胸膜肺炎放線桿菌毒素ApxIV的致病性及基因缺失弱毒疫苗的研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的豬的一種高度接觸傳染性呼吸道疾病，給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 胸膜肺炎放線桿菌是一種多毒力因子病原菌，RTX（Repeat-in-toxin）毒素是其重要毒力因子。目前研究證實(shí)APP中存在4種RTX毒素，分別為Apx

2、Ⅰ，ApxⅡ，ApxⅢ和ApxⅣ。毒素ApxⅠ，ApxⅡ，ApxⅢ已被證實(shí)在APP致病過(guò)程中起重要作用，目前對(duì)ApxⅣ在APP致病過(guò)程中的作用并不清楚。為闡明ApxⅣ與APP致病性的關(guān)系以及開(kāi)發(fā)更為安全高效的基因工程弱毒疫苗，本研究以本實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的APP血清7型毒素apxⅡC單基因缺失突變株HB04C-為親本菌株，通過(guò)同源重組和負(fù)向篩選的方法，成功缺失了apxⅣA基因，構(gòu)建了APP apxⅡC和apxⅣA雙基因缺失突變株QDS01。

3、同時(shí)，以APP-Escherichia．coli穿梭載體pJFF224-XN為基礎(chǔ)，構(gòu)建了apxⅣA基因缺失突變株的互補(bǔ)菌株QA01。并對(duì)APP雙基因缺失突變株QDS01、單基因缺失突變株HB04C-、互補(bǔ)菌株QA01的生物學(xué)特性和/或免疫原性進(jìn)行了研究，主要研究?jī)?nèi)容包括：
　　 1．同源臂的擴(kuò)增與自殺性重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 根據(jù)Genbank中公布的血清1型APP4074株apxⅣ基因的序列（AF021919），從

4、HB04C-中克隆到apxⅣA基因N端2745 bp的片段，將其連接到pBluescript SK載體上，通過(guò)BamHⅠ/SmaⅠ雙酶切后，用Klenow片段補(bǔ)平BamHⅠ粘性末端，與SmaⅠ平端連接，得到含有缺失了605 bp的apxⅣ基因ΔapxⅣAN，用SalⅠ/NotⅠ將ΔapxⅣAN從pBluescript SK載體上切下來(lái)連接到經(jīng)同樣酶切的自殺性質(zhì)粒pEMOC2上，得到缺失apxⅣA基因的重組自殺性質(zhì)粒pEΔⅣA。
　

5、　 2．雙基因缺失突變株和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
　　 以含有重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pEΔⅣA的大腸桿菌B2155為供體菌，以HBO4C-為受體菌，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移和氯霉素（Cm）抗性篩選，獲得帶有Cm抗性的單交換菌株，鑒定正確后，將其接種到不含Cm抗性的TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)，再涂到含有蔗糖抗性的培養(yǎng)基，篩選出蔗糖抗性（SurR）和氯霉素敏感（Cms）的菌株，通過(guò)PCR、序列分析和Southern blot驗(yàn)證突變株正確，將雙基因缺失突變株命名為QDS

6、01。通過(guò)PCR從APP分離株HB04基因組中克隆得到全長(zhǎng)apxⅣ基因，將其連接到．APP-E coli穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN中，得到互補(bǔ)質(zhì)粒pVC3，將其電轉(zhuǎn)化到雙基因缺失突變株QDS01，通過(guò)氯霉素抗性篩選得到互補(bǔ)菌株，命名為QA01，并檢驗(yàn)了穿梭質(zhì)粒在APP中的遺傳穩(wěn)定性和ApxⅣ的表達(dá)活性。
　　 3．突變株生物學(xué)特性的研究
　　 將APP apxⅡC和apxⅣA雙基因缺失菌株QDS01在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，

7、通過(guò)PCR鑒定，證明該缺失菌株能夠穩(wěn)定遺傳。將QDS01和apxⅡC單基因缺失親本菌株HBO4C-進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明，QDS01的增殖能力沒(méi)有發(fā)生明顯變化，說(shuō)明apxⅣA基因的缺失對(duì)APP的體外增殖能力無(wú)影響。檢測(cè)了突變株對(duì)Balb/C小鼠的致病力，結(jié)果表明QDS01較親本菌HB04C-毒力下降了約3倍。
　　 4．突變株對(duì)仔豬的致病性
　　 將APP血清7型分離株HB04、apxⅡC單缺失株HB04C

8、-、apxⅡC/apxⅣA雙缺失株QDS01以及互補(bǔ)菌株QA01通過(guò)氣管接種6周齡仔豬，通過(guò)感染后臨床癥狀、肺部損傷指數(shù)、血液生化指標(biāo)以及病理切片來(lái)評(píng)價(jià)不同APP菌株致病力的差異。結(jié)果表明，雙基因缺失株QDS01對(duì)仔豬致病力明顯低于HB04C-，且攜帶apxⅣ基因的穿梭質(zhì)粒pVC3可恢復(fù)其致病力。證明毒素ApxⅣ在APP致病過(guò)程中起重要作用。
　　 5．ApxⅣAM的克隆表達(dá)及鑒別ELISA診斷方法的初步建立
　　 克隆

9、QDS01中缺失的基因片段apxⅣAM，并連接到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX-apxⅣAM，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，得到融合蛋白GST-ApxⅣAM，通過(guò)親和層析獲得純化的GST-ApxⅣAM。用Western blot鑒定其免疫原性。以純化后的蛋白作為診斷抗原包被酶標(biāo)板，通過(guò)方陣滴定確定了抗原最佳包被濃度和最佳血清稀釋倍數(shù)。通過(guò)對(duì)APP陰性血清檢測(cè)界定該ELISA的陰陽(yáng)性界限。

10、初步建立了基于融合表達(dá)蛋白的ApxⅣAM-ELISA檢測(cè)方法。
　　 6．突變株對(duì)小鼠的免疫效力試驗(yàn)
　　 取48只Balb/C小鼠，隨機(jī)分為6組，其中第1和4組以1.0×107CFU的QDS01通過(guò)腹腔注射免疫，第2和5組以相同方式接種HB04C-，剩余兩組接種TSB作為空白對(duì)照。間隔14天加強(qiáng)免疫，第28天以10×LD50的APP血清7型菌株WF83（1×107CFU）和10×LD50的APP血清1型菌株4074（1

11、.8×106 CFU）攻毒，連續(xù)觀察5天，記錄小鼠發(fā)病和死亡情況。于0天、14天和28天由尾靜脈采血，檢測(cè)小鼠對(duì)．ApxⅡA，ApxⅣA和ApxⅣAM的抗體水平。結(jié)果表明，QDS01可以刺激小鼠產(chǎn)生對(duì)ApxⅡA，ApxⅣA的抗體，但不產(chǎn)生對(duì)ApxⅣAM的抗體，而親本菌HB04C-二免后ApxⅣAM抗體為陽(yáng)性，說(shuō)明ApxⅣAM-ELISA檢測(cè)方法可用于野毒菌株和apxⅣA基因缺失突變株的鑒別診斷。免疫小鼠對(duì)血清7型APP的攻擊均可提供10

12、0％保護(hù)，對(duì)血清1型APP攻擊保護(hù)率為75％。
　　 7．突變株對(duì)仔豬的免疫效力試驗(yàn)
　　 取14頭APP血清學(xué)和病原學(xué)陰性仔豬，隨機(jī)分為3組，第1組5頭用1.3×109CFU的QDS01以氣管接種方式免疫仔豬，第2組用HB04C-以相同方式進(jìn)行免疫，第3組4頭接種TSB作為空白對(duì)照。于首免后21天進(jìn)行二免，二免后兩周用血清1型菌株4074攻毒。觀察記錄其臨床癥狀，于7天后將存活仔豬處死，剖檢觀察肺部損傷狀況?？瞻讓?duì)照組