microRNA-133a在心肌梗死大鼠心肌纖維化中的作用及機制.pdf

1、目的: microRNA(miRNA)是一類生物體自身產(chǎn)生的非編碼蛋白質(zhì)的小分子RNA，通過調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和/或翻譯水平的表達，廣泛參與生命進程及疾病發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與心肌纖維化、心肌肥厚等心血管疾病的病理生理關(guān)系密切。心肌梗死是嚴(yán)重危害人類健康的心血管疾病，心梗后出現(xiàn)的心肌纖維化能影響心臟功能甚至誘發(fā)猝死等不良預(yù)后。本實驗觀察miR-133a及轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TG

2、F-β1)和結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)在心梗大鼠不同時間點的表達變化;通過9型重組腺相關(guān)病毒(recombinantadeno-associated virus9，rAAV9)上調(diào)心梗后miR-133a表達，觀察miR-133a過表達對TGF-β1、CTGF轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的影響及對心肌纖維化的調(diào)控作用，探討miR-133a在心肌梗死后心肌纖維化中的作用及機制。
　　

3、 方法:1.通過冠狀動脈前降支縫扎法，建立心肌梗死大鼠模型，隨機分為1周、2周、4周組，另設(shè)假手術(shù)組（Sham組）。采用心臟超聲檢測心功能相關(guān)指標(biāo)，Masson染色觀察心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)、免疫組化法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原表達;并用實時熒光定量PCR法(realtime-qPCR)檢測心肌miR-133a及TGF-β1、CTGF mRNA表達改變，蛋白印跡法(westernblot)檢

4、測TGF-β1及CTGF蛋白的表達變化。
　　 2.構(gòu)建攜帶大鼠miR-133a基因及標(biāo)記基因綠色熒光蛋白ZsGreen的AAV質(zhì)粒載體，基因測序，酶切、PCR鑒定。在293細胞中包裝病毒載體rAAV9-ZsGreen-pre-miR-133a，提取純化后測定滴度。
　　 3.通過冠脈灌注法分別轉(zhuǎn)導(dǎo)PBS緩沖液、rAAV9-ZsGreen和rAAV9-ZsGreen-pre-miR-133a至大鼠心臟，再行冠狀動脈前降支

5、縫扎手術(shù)，分別設(shè)為PBS組、ZsGreen組和miR-133a組。同時另設(shè)Sham組。熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達分布情況。4周后，采用心臟超聲檢測心功能相關(guān)指標(biāo)，Masson染色觀察CVF、免疫組化法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原表達;并用realtime-qPCR檢測心肌miR-133a及TGF-β1、CTGF mRNA表達改變，western blot檢測TGF-β1及CTGF蛋白的表達變化。
　　 結(jié)果:1.與Sham組比較，心梗4周組

6、大鼠心功能明顯降低(P＜0.05)。心肌CVF及Ⅰ、Ⅲ型膠原表達水平在心梗后隨著時間進展逐漸增高。Ⅰ/Ⅲ型膠原比值在心梗1周時無明顯升高(P＞0.05)，2周后出現(xiàn)顯著升高(P＜0.01)，并在4周進一步升高(P＜0.01)。
　　 2.與Sham組比較，心肌miR-133a表達水平在心梗1周時顯著降低(P＜0.01)，表達水平為Sham組的9±4％。之后隨著時間進展miR-133a表達逐漸回升，但仍顯著低于Sham組(P＜0.

7、01)。4周組miR-133a表達水平為Sham組的22±6％。
　　 3.心肌TGF-β1和CTGF的mRNA及蛋白表達水平均在心梗后出現(xiàn)顯著升高(P＜0.01)。TGF-β1 mRNA和蛋白表達水平分別在心梗1周和2周時達高峰后逐漸下降。4周組TGF-β1 mRNA和蛋白水平分別為Sham組的4.3倍和2.5倍左右。CTGF mRNA水平在心梗2周時達到高峰后下降，蛋白表達隨著時間進展增高。4周組CTGF mRNA和蛋白水平

8、分別為Sham組的3.1倍和1.9倍左右。
　　 4.基因測序顯示中間載體質(zhì)粒攜帶正確的大鼠miR-133a序列，酶切結(jié)果顯示成功構(gòu)建了中間載體質(zhì)粒和rAAV質(zhì)粒。純化提取病毒后，生物滴度測定顯示病度為2×107TU/ml。
　　 5.熒光顯微鏡下觀察，ZsGreen組及miR-133a組心肌組織有大量綠色熒光廣泛均勻分布。導(dǎo)入攜帶miR-133a的rAAV9載體后，心肌的miR-133a表達水平較Sham組、PBS組及

9、ZsGreen組顯著升高(P＜0.01)。miR-133a組的miR-133a表達水平是PBS組的6.8倍左右，是Sham組的1.6倍左右。
　　 6.miR-133a組心功能較PBS組及ZsGreen組明顯改善(P＜0.05)。miR-133a組的心肌CVF及Ⅰ、Ⅲ膠原表達水平、Ⅰ/Ⅲ型膠原比值較PBS組及ZsGreen組明顯降低(P＜0.01)。
　　 7.miR-133a組心肌TGF-β1 mRNA表達水平與PBS

10、組及ZsGreen組比較無明顯差異(P＞0.05)，CTGF mRNA表達水平較PBS組及ZsGreen組明顯降低(P＜0.01)。miR-133a組心肌TGF-β1及CTGF蛋白表達水平較PBS組及ZsGreen組明顯降低(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.心肌miR-133a表達水平在心梗1周時降低，之后稍有回升，4周時仍維持在較低水平。心肌TGF-β1 mRNA和蛋白表達水平分別在心梗1周及2周時達高峰，4