RNA干擾技術(shù)探索CTGF在心肌纖維化中的作用.pdf

1、本文主要從以下三個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 靶向大鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定和篩選
　　目的:
　　構(gòu)建4個(gè)靶向大鼠結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的shRNA真核表達(dá)載體,并利用RT-PCR和Western Blotting技術(shù)篩選出高效特異的RNA干擾真核表達(dá)載體。
　　方法:
　　根據(jù)大鼠CTGF mRNA序列設(shè)計(jì)并合成4對(duì)shRNA寡核苷酸片段,退火形成雙鏈并克隆進(jìn)入載體 p

2、Genesil-1,進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序分析。然后以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大鼠心肌成纖維細(xì)胞,流式細(xì)胞技術(shù)分選出成功轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性細(xì)胞。通過(guò)RT-PCR和Western Blotting技術(shù)對(duì)成功構(gòu)建的4個(gè)shRNA干擾質(zhì)粒進(jìn)行有效性篩選,分析其CTGF mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　酶切證實(shí)轉(zhuǎn)錄shRNA的目的基因片段已成功克隆入載體,經(jīng)測(cè)序證明與設(shè)計(jì)完全符合;在成功轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞48 h后,與空白對(duì)照組比較

3、,有3組細(xì)胞CTGF mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低;而轉(zhuǎn)染非特異陰性質(zhì)粒對(duì)照組CTGF mRNA及蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建了4個(gè)出靶向大鼠CTGF的shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒重組體,并通過(guò)轉(zhuǎn)染心肌成纖維細(xì)胞篩選出高效特異的質(zhì)粒重組體,為進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)外心肌纖維化的RNA干擾研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 RNA干擾對(duì)大鼠體外培養(yǎng)細(xì)胞CTGF及纖維化指標(biāo)的影響
　　實(shí)驗(yàn)一：大鼠心肌細(xì)胞結(jié)締組

4、織生長(zhǎng)因子的誘導(dǎo)表達(dá)及RNA干擾研究
　　目的:
　　探討心肌細(xì)胞對(duì)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的基礎(chǔ)表達(dá)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)對(duì)其分泌的誘導(dǎo)作用,并進(jìn)一步研究以RNA干擾技術(shù)靶向抑制CTGF對(duì)下游纖維化因子的影響。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)分為以下5組--組I:單純心肌細(xì)胞組;組II:TGF-β1誘導(dǎo)組;組III:陰性質(zhì)粒組;組IV:RNA干擾組;組V:脂質(zhì)體組。分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞,以5ng/

5、ml終濃度的TGF-β1對(duì)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),再通過(guò)脂質(zhì)體法將靶向大鼠CTGF的shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞,流式細(xì)胞技術(shù)分選出成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。通過(guò)RT-PCR和Western Blotting技術(shù)進(jìn)一步研究各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞CTGF、纖維連接蛋白(FN)的mRNA及蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　單純心肌細(xì)胞組對(duì)CTGF、纖維連接蛋白(FN)及均有低水平的基礎(chǔ)分泌,在予以TGF-β1誘導(dǎo)后表達(dá)水平顯著升高(P<0.

6、01);而在靶向特異性RNA干擾后,上述因子的表達(dá)均被顯著抑制(P<0.01);并且纖維化因子FN的表達(dá)水平與促纖維化因子CTGF的表達(dá)顯著相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　心肌細(xì)胞可自主低水平分泌或誘導(dǎo)后高表達(dá)CTGF及下游纖維化因子FN,提示心肌細(xì)胞主動(dòng)參與了心肌纖維化及心臟重塑過(guò)程;而通過(guò) RNA干擾靶向抑制 CTGF后可阻抑心肌細(xì)胞分泌下游纖維化因子,進(jìn)一步提示CTGF是促心肌纖維化的關(guān)鍵性細(xì)胞因子,而RNA干擾是一種特異高效

7、的很有前途的干預(yù)手段。
　　實(shí)驗(yàn)二：RNA干擾選擇性下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的表達(dá)
　　目的:
　　探討血管平滑肌細(xì)胞對(duì)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的基礎(chǔ)分泌及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)對(duì)其分泌的誘導(dǎo)作用,并進(jìn)一步研究以RNA干擾技術(shù)靶向抑制CTGF對(duì)下游纖維化因子的影響。
　　方法:
　　分離培養(yǎng)成年大鼠血管平滑肌細(xì)胞,以5ng/ml終濃度的TGF-β1對(duì)培養(yǎng)的心肌細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo),再通過(guò)脂質(zhì)

8、體法將靶向大鼠CTGF的shRNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入血管平滑肌細(xì)胞,200ug/ml終濃度的G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株后培養(yǎng)增殖進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組如下--組I:單純血管平滑肌細(xì)胞組;組II:TGF-β1刺激誘導(dǎo)組;組III:陰性質(zhì)粒對(duì)照組;組IV: RNA干擾組;組V:單純脂質(zhì)體組。通過(guò)RT-PCR和(或)Western Blotting技術(shù)進(jìn)一步研究各實(shí)驗(yàn)組心肌細(xì)胞CTGF、纖維連接蛋白(FN)的mRNA及蛋白的表達(dá)水平。
　

9、　結(jié)果:
　　血管平滑肌細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)對(duì)CTGF、纖維連接蛋白(FN)均有低水平的分泌表達(dá),5ng/ml終濃度的TGF-β1可以誘導(dǎo)其表達(dá)水平顯著升高(P<0.01);而在靶向特異性RNA干擾后,與誘導(dǎo)組比較,上述因子的表達(dá)均被顯著抑制(P<0.01);并且纖維化因子FN的表達(dá)水平與促纖維化因子CTGF的表達(dá)有顯著相關(guān)性。
　　結(jié)論:
　　血管平滑肌細(xì)胞可自主分泌CTGF及細(xì)胞外基質(zhì)成分;而通過(guò)RNA干擾靶向抑制CTG

10、F后可阻抑血管平滑肌細(xì)胞分泌下游纖維化因子。提示血管平滑肌細(xì)胞可主動(dòng)參與心血管重塑及纖維化,而RNA干擾靶向沉默CTGF基因的表達(dá)可以有效干預(yù)纖維化過(guò)程。
　　第三部分 RNA干擾靶向抑制CTGF對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心臟纖維化的影響
　　實(shí)驗(yàn)一：應(yīng)用質(zhì)粒重組體轉(zhuǎn)染大鼠心肌的可行性研究
　　目的:
　　比較應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofectamine2000經(jīng)不同途徑在體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒重組體基因至大鼠心肌的可行性。
　

11、　方法:
　　構(gòu)建含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。將22只雄性SD大鼠,隨機(jī)分為4組:陰性對(duì)照組(1組,n=4),心肌注射組(2組,n=6),尾靜脈注射組(3組,n=6),冠狀動(dòng)脈灌注組(4組,n=6),分別采用心肌局部注射,尾靜脈液壓注射,冠狀動(dòng)脈灌注三種不同方式實(shí)施在體心肌轉(zhuǎn)染。2~4組于轉(zhuǎn)染后2d,14d時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)處死3只大鼠,取心肌組織作快速冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)情況。
　　結(jié)

12、果:
　　在熒光顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)情況,陰性對(duì)照組隱約可見(jiàn)淡綠色熒光,第2天各轉(zhuǎn)染組均可見(jiàn)明顯的綠色熒光分布于所取心臟組織。通過(guò)相應(yīng)軟件分析系統(tǒng)分析,結(jié)果顯示各轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度較陰性對(duì)照組相比其差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),心肌注射組和尾靜脈注射組間熒光強(qiáng)度差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.17),經(jīng)冠狀動(dòng)脈灌注轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度較其余兩組增強(qiáng)7.37倍(p=0.013)。第2周轉(zhuǎn)染各組熒光強(qiáng)度明顯減弱,與陰性對(duì)照組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

13、(p=0.41)。
　　結(jié)論:
　　陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofectamine2000可有效的將質(zhì)粒重組體通過(guò)各種方式轉(zhuǎn)染心肌組織,而通過(guò)冠狀動(dòng)脈灌注轉(zhuǎn)染可以明顯提高其轉(zhuǎn)染效率。
　　實(shí)驗(yàn)二：RNA干擾靶向抑制CTGF對(duì)心肌纖維化的影響
　　目的:
　　研究RNA干擾技術(shù)靶向抑制結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織纖維化指標(biāo)的影響。
　　方法:
　　20只自發(fā)性高血壓大鼠隨機(jī)分為未

14、干預(yù)的SHR組和RNA干擾(RNAi)組,并設(shè)置WKY組大鼠為正常對(duì)照。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法通過(guò)冠狀動(dòng)脈灌注聯(lián)合尾靜脈注射進(jìn)行目標(biāo)質(zhì)粒的體內(nèi)轉(zhuǎn)染,體內(nèi)RNA干擾持續(xù)進(jìn)行8周,期間監(jiān)測(cè)各組大鼠血壓水平。在 RNA干擾結(jié)束后,處死大鼠獲取血液和心臟標(biāo)本,計(jì)算左室重量/體重比(LVW/BW),ELISA法檢測(cè)血漿纖維連接蛋白(FN)和層粘蛋白(LN)濃度; RT-PCR和Western blotting檢測(cè)心肌組織CTGF及FN的mRNA和蛋白表達(dá),

15、免疫組化技術(shù)分析CTGF及FN的空間表達(dá)。天狼星紅染色及羥脯氨酸測(cè)定分析心肌組織膠原類型及代謝水平。
　　結(jié)果:
　　RNA干擾組血壓水平和LVW/BW較SHR組無(wú)明顯差異(P>0.05),RNA干擾顯著下調(diào)CTGF及FN的mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.01);免疫組化顯示了同樣的抑制效應(yīng),而且觀察到CTGF及FN不同的空間表達(dá),CTGF主要存在于心肌細(xì)胞,而FN主要在心肌間質(zhì)表達(dá)。天狼星紅染色顯示 RNA干擾組膠原沉積減少,