骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)源性IL-6調(diào)節(jié)OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離共培養(yǎng)對OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響
　　目的：利用氧糖剝奪(OGD)損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞與MSCs分離共培養(yǎng)模型，探討MSCs對OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響。
　　方法：原代大鼠培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，利用星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白GFAP對其進(jìn)行鑒定。建立星形膠質(zhì)細(xì)胞OGD損傷模型，并與MSCs分離共培養(yǎng)，同時以未損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞（control組）和單獨(dú)OGD損傷組（OGD組）為對照。ELISA檢測共培養(yǎng)

2、上清中IL-6分泌情況，Real-time PCR和western blot分別檢測IL-6信號通路相關(guān)因子及Bcl-2、Bax凋亡相關(guān)因子的mRNA及蛋白表達(dá)變化。鈣影像系統(tǒng)檢測ATP刺激后不同處理組星形膠質(zhì)細(xì)胞胞中Ca2+濃度，CCK-8試劑盒檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖狀況。
　　結(jié)果：
　?。?）經(jīng)GFAP免疫熒光方法鑒定，原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度超過95％。
　?。?）ELISA檢測顯示MSCs分離共培養(yǎng)后的損傷

3、星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)液中IL-6的分泌水平明顯高于OGD組（P<0.05）。
　?。?）與MSCs分離共培養(yǎng)后，OGD損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞中凋亡因子Bcl-2表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），Bax表達(dá)水平略有降低，但Bcl-2/Bax的表達(dá)水平比值卻明顯高于其他兩組（P＜0.05）。
　　（4）MSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6信號通路相關(guān)分子IL-6R和STAT3在mRNA和蛋白表達(dá)水平均呈現(xiàn)顯著上調(diào)。
　　

4、（5）與control組相比，ATP刺激可誘導(dǎo)OGD損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+水平瞬間升高（P＜0.001），而MSCs分離共培養(yǎng)可顯著降低OGD損傷細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平（P＜0.05）。
　　（6）OGD損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖加速，而MSCs分離共培養(yǎng)可抑制損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖能力。
　　結(jié)論：OGD損傷導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞Bcl-2/Bax表達(dá)水平比值下降，胞內(nèi)Ca2+濃度增加，細(xì)胞增殖能力上調(diào)；而MSCs分離共培養(yǎng)上調(diào)

5、共培養(yǎng)上清中IL-6分泌水平，激活OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6R/STAT3信號通路，提高Bcl-2/Bax的比值，降低損傷細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+釋放，抑制損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖。
　　第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)源性IL-6對星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)
　　目的：利用siIL-6 MSCs穩(wěn)定細(xì)胞株，與OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞分離共培養(yǎng)，闡明MSCs內(nèi)源性IL-6對損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用。
　　方法：將siIL-6 MSCs

6、細(xì)胞與OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞分離共培養(yǎng)，并以GFP MSCs為對照，ELISA測定共培養(yǎng)上清中IL-6分泌水平，Real-time PCR和western blotting分別檢測 IL-6信號通路關(guān)鍵分子IL-6R、STAT3及凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax的mRNA及蛋白表達(dá)水平，鈣影像系統(tǒng)測定分離共培養(yǎng)后損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度變化情況，CCK-8試劑盒檢測損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果：
　　（1）s

7、iIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)可明顯下調(diào)培養(yǎng)上清IL-6的分泌水平（P＜0.01）。
　?。?）siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)后，OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6信號通路關(guān)鍵分子IL-6R與p-STAT3表達(dá)水平均顯著下降（P＜0.01，P＜0.01）。
　　（3）OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞與siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)后，其凋亡因子Bcl-2的表達(dá)水平明顯低于GFP MSCs組（P＜0.01），Bax表達(dá)水平略有增高，但

8、Bcl-2/Bax的表達(dá)水平比值顯著減小，與GFP MSCs組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。
　?。?）ATP可誘導(dǎo)與siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)后的損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放明顯增加（P＜0.05）。
　?。?）siIL-6 MSCs分離共培養(yǎng)促進(jìn)損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。
　　結(jié)論當(dāng)MSCs中IL-6分泌水平下降時，與其共培養(yǎng)的OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6R/STAT3信號通路活性減弱，Bcl-

9、2/Bax表達(dá)水平比值下降，胞內(nèi)Ca2+釋放增加，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)。
　　第三部分外源性細(xì)胞因子IL-6對OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響
　　目的：應(yīng)用外源性細(xì)胞因子IL-6干預(yù)OGD損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞，比較重組細(xì)胞因子IL-6與MSCs內(nèi)源性分泌IL-6對損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用。
　　方法：將重組細(xì)胞因子IL-6處理OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞48h，并以IL-6未處理的OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞為對照，ELISA測定培養(yǎng)上清中

10、IL-6的濃度，western blotting檢測兩組損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞中IL-6信號通路關(guān)鍵分子IL-6R、STAT3及凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)水平變化。鈣影像系統(tǒng)測定損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞中Ca2+濃度，CCK-8試劑盒檢測損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果：
　?。?）IL-6干預(yù)后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的濃度盡管較單獨(dú)OGD損傷組有所增高，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著差異（P＞0.05）。
　?。?）外

11、源性IL-6可顯著上調(diào)IL-6R及磷酸化STAT3的表達(dá)水平。
　?。?）IL-6干預(yù)組細(xì)胞凋亡因子Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯升高，Bax的表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2/Bax表達(dá)水平比值顯著增加，與OGD損傷組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。
　?。?）ATP刺激可明顯誘導(dǎo)IL-6干預(yù)組中OGD損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，但其升高幅度與單獨(dú)OGD損傷組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　（5）損