噬菌體展示技術(shù)生物淘選結(jié)締組織生長因子表位的研究.pdf

1、研究目的：制備結(jié)締組織生長因子(CTGF)抗原；對本實驗組制備的CTGF單克隆抗體的特異性進行檢測；運用噬菌體展示技術(shù)篩選結(jié)締組織生長因子的抗原表位。 研究方法：1、從人血管內(nèi)皮細胞中提取總：RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，設(shè)計特異性引物，通過PCR方法擴增CTGF-C區(qū)242-349位氨基酸基因，插入噬菌體包膜蛋白基因的上游，制備出CTGF融合蛋白；2、采用體外人腎系膜細胞珠培養(yǎng)方法，用含30 mmol/L葡萄糖的DMEM干預(yù)2天

2、后提取結(jié)締組織生長因子(CTGF)蛋白，用Western blot方法對本實驗組制備的CTGF單克隆抗體特異性及CTGF融合蛋白進行定性檢測；3、以CTGF單克隆抗體為篩選工具，對噬菌體隨機12肽庫進行篩選，逐步增加選擇壓力，經(jīng)過三輪篩選后隨機挑取4個陽性克隆測序，用競爭抑制和間接ELISA方法檢測噬菌體陽性克隆的特異性。 結(jié)果：1、成功克隆CTGF-C區(qū)基因，插入表達載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得分子量為30ku的融合蛋白，免疫學(xué)

3、檢測證實為CTGF蛋白；2、Westernblot實驗結(jié)果證明：本實驗組制備的CTGF單克隆抗體既可以與天然CTGF蛋白結(jié)合，也可以與重組CTGF蛋白結(jié)合；3、噬菌體文庫經(jīng)過三輪篩選后得到了陽性克隆。測序結(jié)果表明，隨機挑取的4個陽性克隆的序列高度一致。推導(dǎo)獲得12個氨基酸的小肽序列(GEPQTKLFSFPL)，命名為ZD521；競爭抑制和間接ELISA分析結(jié)果表明：CTGF單克隆抗體與陽性噬菌體的結(jié)合具有特異性。 結(jié)論：本研究利