采用噬菌體展示技術(shù)淘選玉米赤霉烯酮模擬表位的研究.pdf

1、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種廣泛污染谷物及其制品的真菌毒素，對動(dòng)物及人類具有生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、誘發(fā)腫瘤及肝臟毒性等。目前已有的檢測ZEN的方法有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層色譜法、ELISA檢測法等。ELISA檢測法靈敏度高、操作簡單、適用于檢測大量樣品，使用較為廣泛。但是在ELISA檢測中需要使用ZEN毒素標(biāo)準(zhǔn)品，該標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴且會(huì)對檢測人員造成身體損害。本研究以自制的抗ZEN單克隆抗

2、體7G5為配體，采用噬菌體展示技術(shù)首次淘選到ZEN的模擬表位，并建立了ZEN無毒ELISA方法。主要研究內(nèi)容如下： 1、ZEN全抗原的合成。采用活潑酯法將ZEN半抗原與BSA及KLH蛋白偶聯(lián)成ZEN全抗原，鑒定ZEN全抗原后免疫BALB/C雌性小鼠。 2、抗ZEN單克隆抗體的制備。將免疫后BALB/C小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2-O/Ag-14在PEG的作用下進(jìn)行融合。采用間接ELISA和間接競爭ELISA的方法篩選陽

3、性克隆，并用有限稀釋法對陽性克隆進(jìn)行克隆化。獲得一株抗ZEN單克隆抗體7G5，該抗體對三種ZEN的結(jié)構(gòu)類似物Zearalanone，α-Zearalanol，β-Zearalanol以及桔霉素(Citrinin)，脫氧鐮刀雪腐菌烯醇(Deoxynivalenol)的交叉反應(yīng)率分別為3.8％，1.9％，23％，＜0.01％，＜0.01％。以該抗體建立的間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低檢測下限為0.1ng/mL，線性范圍為0.1ng/mL-

4、100ng/mL，半量抑制濃度(IC5o)為8ng/mL。 3、采用噬菌體展示技術(shù)淘選ZEN的模擬表位。以抗ZEN單克隆抗體7G5為配體，采用逐輪減少抗體包被濃度，交換使用封阻液中蛋白質(zhì)種類的方法，在噬菌體七肽庫中淘選ZEN的模擬表位，經(jīng)三輪淘選后，隨機(jī)挑取20個(gè)克隆測序，以間接ELISA和間接競爭ELISA確定陽性克隆。結(jié)果獲得10種序列，間接競爭ELISA顯示其中2種序列為ZEN的模擬表位。兩種ZEN模擬表位的氨基酸序列分別