結(jié)締組織生長因子特異性結(jié)合肽的篩選及其生物活性的研究.pdf

1、目的：纖維化是多種慢性病的常見病理過程之一。作為多個信號通路中的下游作用因子，結(jié)締組織生長因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)在纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，因此CTGF是一個更具特異性的靶點。對于細胞因子拮抗劑的研究是目前纖維化疾病治療中的熱點。本研究試圖從隨機十二肽庫中篩選與CTGF特異性結(jié)合的噬菌體克隆，利用基因工程技術(shù)獲得與CTGF特異性結(jié)合的小肽，初步研究該小肽是否能抑制CTGF促

2、人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖及遷移的活性。為開發(fā)CTGF小分子抑制劑打下基礎(chǔ)，進而為纖維化疾病的治療提供新途徑。 方法：1.用基因重組方法制備硫氧化還原蛋白(TrxA)及硫氧化還原蛋白-結(jié)締組織生長因子(TrxA-CTGF)融合蛋白；噬菌體隨機十二肽庫經(jīng)TrxA預(yù)吸附后，與TrxA-CTGF結(jié)合，逐步增加選擇壓力，經(jīng)過4輪親和篩選后隨機挑取10個陽性克隆，提取單鏈DNA后進行測序；用直接噬菌體-ELISA試驗檢測噬菌體剛性克隆與CTGF

3、結(jié)合的特異性。2.設(shè)計并合成一段帶有腸激酶切割位點的基因片段，插入pET-32(a)+質(zhì)粒載體中硫氧化還原蛋白基因下游，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入E.coliBL21表達菌中，用終濃度1mmol·L-1的IPTG誘導表達融合蛋白；用熱變性和硫酸銨分級沉淀對融合蛋白進行初步純化，用親和層析進一步純化，經(jīng)腸激酶切割后用凝膠過濾層析分離獲得目的小肽；用反相色譜對所獲小肽進行純度鑒定。3.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，采利用MTT試驗觀察所獲小肽是否能抑制

4、CTGF促人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的作用、利用Transwell試驗觀察所獲小肽是否能抑制CTGF促人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移的作用。 結(jié)果：1.10個噬菌體陽性克隆中8個DNA序列完全一致，命名為810A，另有2個序列各不相同，分別命名為810B、810C；根據(jù)三聯(lián)密碼子推導810A、810B、810C的氨基酸序列分別為LLADXXXXRPWT、HATGXXXXSLSH、TSGYXXXXGRWR；計算其相對分子量分別為1448.627D

5、、1218.315D、1502.725D，等電點分別為7.985、8.075、12.185；陽性噬菌體克隆810A用直接噬菌體-ELISA試驗證實能與CTGF發(fā)生特異性結(jié)合，與TrxA及陰性對照比較差異顯著(P<0.05)。2.所構(gòu)建的重組質(zhì)粒測序結(jié)果與預(yù)期序列一致；誘導表達后經(jīng)SDS-PAGE鑒定，發(fā)現(xiàn)在相對分子量20000D處有濃密的表達條帶出現(xiàn)，與預(yù)期分子量一致；融合蛋白用熱變性、硫酸銨分級沉淀、親和層析、腸激酶切割、凝膠過濾層析

6、分離獲得目的小肽，用反相色譜鑒定其純度大于95％；最終每升發(fā)酵液獲得3.4mg目的肽。3.0.1μg·mL-1CTGF能促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖，與陰性對照比較差異顯著(P<0.05)，濃度為10μg·mL-1的小肽810A能抑制0.1μg·mL-1CTGF促人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的作用，與陽性對照比較差異顯著(P<0.05)，而濃度分別為2μg·mL-1、0.4μg·mL-1、0.08μg·mL-1、0.016μg·mL-1、0.003

7、2μg·mL-1、0.00064μg·mL-1的小肽810A不能抑制0.1μg·mL-1CTGF促人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的作用，與陽性對照比較無顯著差異(P>0.05)：1μg·mL-1CTGF可促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移，與陰性對照相比有顯著差異(p<0.05)，濃度分別為1mg·mL-1、100μg·mL-1、10μg·mL-1、1μg·mL-1、0.1μg·mL-1的小肽810A能抑制1μg·mL-1CTGF促人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移的作