BPA暴露導(dǎo)致F2代胰島素抵抗的效應(yīng)及其表觀遺傳機(jī)制研究.pdf

1、在機(jī)體早期發(fā)育的過(guò)程中暴露于雙酚A可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)育關(guān)鍵器官和組織發(fā)生表觀遺傳特征的改變，并導(dǎo)致成年階段的能量代謝穩(wěn)態(tài)的破壞，產(chǎn)生胰島素抵抗、糖耐量受損等2型糖尿病特征。如果F0代的母體在懷孕和哺乳階段受到了雙酚A的直接暴露，則其F1代的原始生殖細(xì)胞同樣處于BPA的直接暴露之下，并由此導(dǎo)致F1代生殖細(xì)胞表觀遺傳信息的改變，這種改變可以通過(guò)生殖細(xì)胞再傳遞給F2代個(gè)體。雙酚A可以通過(guò)改變?cè)忌臣?xì)胞的表觀遺傳信息，從而導(dǎo)致隔代的毒理效應(yīng)，這種推

2、理存在理論上的可能。因此，F(xiàn)0代母體在圍產(chǎn)期暴露于雙酚A是否會(huì)使得F2代個(gè)體與F1代一樣，產(chǎn)生能量代謝紊亂的癥狀，是一個(gè)不可回避的問(wèn)題。在本研究中，F(xiàn)0代SD大鼠在懷孕和哺乳期間通過(guò)灌胃的方式每天給予40μg/kg/day的BPA暴露，而隨后的與F1代雄鼠交配的雌鼠和F2代大鼠均不再受到BPA的直接暴露。我們通過(guò)葡糖糖耐量實(shí)驗(yàn)（ipGTT）和胰島素耐量（ipITT）實(shí)驗(yàn)，以及瘦素脂聯(lián)素等血生化指標(biāo)來(lái)反映F2代的葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素抵抗水平

3、，并通過(guò)發(fā)現(xiàn)胰島素通路關(guān)鍵基因的表達(dá)改變來(lái)進(jìn)一步證實(shí)胰島素抵抗和糖耐量損傷的狀態(tài)。同時(shí)，我們繼續(xù)在F2代的肝臟和F1代的生殖細(xì)胞中尋找可能的表觀遺傳靶點(diǎn)。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組雙酚A暴露組的F2代大鼠，其葡萄糖耐量誰(shuí)和胰島素耐量水平均出現(xiàn)了明顯下降，同時(shí)肝臟葡萄糖激酶（GCK）的基因相對(duì)表達(dá)水平也顯著下調(diào)。甲基化測(cè)序結(jié)果顯示，GCK啟動(dòng)子區(qū)域的12個(gè)甲基化位點(diǎn)在BPA暴露組的F2代肝臟組織為全部為甲基化的狀態(tài)，而在對(duì)照組F2代

4、大鼠中則有5個(gè)位點(diǎn)為非甲基化的狀態(tài)。在F1的精子中，僅CpG位點(diǎn)-314中在BPA暴露組和對(duì)照組之間呈現(xiàn)不同的甲基化狀態(tài)。而無(wú)論是F2代肝臟還是F1代雄性大鼠的精子，BPA暴露組均出現(xiàn)了明顯地全基因組低甲基化現(xiàn)象。同時(shí)，BPA暴露所導(dǎo)致的F2代胰島素抵抗和糖耐量異常，F(xiàn)2代肝臟Gck基因甲基化模式的改變，以及F1代精子Gck基因甲基化模式的改變，與F1代能量代謝紊亂癥狀和F1代神經(jīng)行為發(fā)育異常之間沒(méi)有顯著地相關(guān)性。提示F2代所產(chǎn)生的現(xiàn)象

5、時(shí)由F0代母鼠圍產(chǎn)期暴露于BPA所直接導(dǎo)致的。
　　本研究的結(jié)論是，F(xiàn)0代妊娠和哺乳期BPA暴露可引起F2代的胰島素抵抗和糖耐量受損通，而DNA甲基化的改變是主要的作用機(jī)制。然而F1代的精子中所攜帶的BPA暴露導(dǎo)致隔代能量代謝紊亂的表觀遺傳信息靶點(diǎn)有待進(jìn)一步地闡明。本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 F0代圍產(chǎn)期BPA暴露對(duì)F2代糖耐量和胰島素抵抗的影響
　　目的：研究F0代母鼠懷孕和哺乳階段BPA暴露對(duì)F2

6、代糖耐量和胰島素抵抗的影響。
　　方法：將F0代孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和BPA暴露組，從受孕第0天開(kāi)始分別進(jìn)行玉米油和BPA（40μg/kg body weight/day）灌胃染毒。F1代雄鼠大鼠成年后與未受到過(guò)BPA暴露的成年雌性大鼠交配，以此產(chǎn)生F2代大鼠。F2代大鼠出生后，記錄每窩產(chǎn)仔數(shù)，并持續(xù)測(cè)量其體重變化和攝食量的變化。F2代大鼠出生后的第9周和第20周，通過(guò)胰島素耐量實(shí)驗(yàn)（ipITT）和葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)F2代大鼠的胰

7、島素抵抗情況和糖耐量水平。同時(shí)用血糖儀分析F2代大鼠的空腹血糖水平，以及使用采用ELISA法分析空腹胰島素、血液瘦素和脂聯(lián)素水平，并通過(guò)血糖和胰島素水平計(jì)算F2大鼠胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）。同時(shí)分析F2代GTT實(shí)驗(yàn)曲線(xiàn)下面積與F1代GTT曲線(xiàn)下面積及F1代水迷宮逃避潛伏期之間的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果：F2代大鼠的每窩死亡率也未受到F0代母鼠BPA暴露的影響。F2代各組組間的產(chǎn)仔數(shù)差異、性別比例以及仔鼠出生體重的差異均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義（p＞0.05）。同時(shí)與對(duì)照組F2代相比，BPA暴露組F2代在生長(zhǎng)國(guó)產(chǎn)中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的體重和攝食量上也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。BPA暴露組F2代大鼠與對(duì)照組F2代大鼠的空腹血糖、瘦素和脂聯(lián)素之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＞0.05）。然而與對(duì)照組相比在F2代大鼠出生后第20周，BPA暴露組的空腹胰島素水平明顯升高（p＜0.05）。通過(guò)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)發(fā)現(xiàn)，BPA暴露組亦有明顯升高（p＜0.05）。同時(shí)，葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量

9、試驗(yàn)的結(jié)果顯示，BPA暴露組F2代大鼠，其的糖耐量水平和胰島素耐量水平均明顯下降（p＜0.05）。同時(shí)F2代GTT實(shí)驗(yàn)曲線(xiàn)下面積與F1代GTT曲線(xiàn)下面積及F1代水迷宮逃避潛伏期之間不具有關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)論：F0代母鼠懷孕和哺乳階段BPA暴露可以導(dǎo)致F2代糖耐量受損，出現(xiàn)胰島素抵抗的癥狀。
　　第二部分 F0代圍產(chǎn)期BPA暴露對(duì)F2代能量代謝相關(guān)基因及肝臟Gck基因甲基化的影響
　　目的：研究F0代母鼠懷孕和哺乳階段BP

10、A暴露對(duì)F2代大鼠能量代謝相關(guān)基因及肝臟Gck基因甲基化模式的影響。
　　方法：將F0代孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和BPA暴露組，從受孕第0天開(kāi)始分別進(jìn)行玉米油和BPA（40μg/kg body weight/day）灌胃染毒。F1代雄鼠大鼠成年后與未受到過(guò)BPA暴露的成年雌性大鼠交配，以此產(chǎn)生F2代大鼠。采用熒光定量PCR法檢測(cè)Gck, NR4A3, NR4A1, IRS-2 and SREBP-1c等基因的相對(duì)表達(dá)水平。采用weste

11、rn blotting免疫印跡技術(shù)對(duì)發(fā)生mRNA表達(dá)發(fā)生改變的基因Gck，在其蛋白表達(dá)水平進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。使用總甲基化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)地F2代大鼠肝臟總甲基化的變化，并通過(guò)亞硫酸鹽直接測(cè)序地方法分析F2代大鼠肝臟Gck基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的變化。同時(shí)分析F2代肝臟總甲基化與F1代GTT曲線(xiàn)下面積及F1代水迷宮逃避潛伏期之間的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果：BPA暴露組 F2代大鼠的Gck基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比(0.77±0.05 vs1.0

12、0±0.06)顯著性升高（p＜0.05）。而NR4A3，NR4A1，IRS-2 and SREBP-1c等胰島素調(diào)控關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)水平在BPA組與對(duì)照組之間，沒(méi)有顯著地統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。F2代肝臟組織中Gck蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組相比也有明顯的下降（p＜0.05）。BPA暴露的F2代大鼠肝臟DNA的總甲基化水平(84.3±0.2％) 發(fā)生了顯著性地降低（p<0.05）。BPA暴露組的F2代大鼠肝臟中，Gck基因的

13、12個(gè)CpG位點(diǎn)全部發(fā)生了甲基化的改變。而在對(duì)照組中CpG位點(diǎn)-314、-280、-93、-4和+5均是非甲基化的狀態(tài)。同時(shí)，F(xiàn)2代肝臟總甲基化與F1代GTT曲線(xiàn)下面積及F1代水迷宮逃避潛伏期之間不具有關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)論：F0代母鼠懷孕和哺乳階段BPA暴露可以導(dǎo)致F2代大鼠Gck基因表達(dá)水平下降及肝臟Gck基因甲基化模式的異常改變。
　　第三部分 F0代圍產(chǎn)期BPA暴露對(duì)F1代精子Gck基因甲基化的影響
　　目的：研究

14、F0代母鼠懷孕和哺乳階段BPA暴露對(duì)F1代成年大鼠精子Gck基因甲基化模式的影響。
　　方法：將F0代孕鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和BPA暴露組，從受孕第0天開(kāi)始分別進(jìn)行玉米油和BPA（40μg/kg body weight/day）灌胃染毒。F1代雄鼠大鼠成年后與未受到過(guò) BPA暴露的成年雌性大鼠交配后，提取其附睪組織并分離出精子。使用總甲基化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)地F1代成年大鼠精子總甲基化的變化，并通過(guò)亞硫酸鹽直接測(cè)序地方法分析F1代大鼠精子

15、Gck基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的變化。采用熒光定量PCR法檢測(cè)Gck基因mRNA表達(dá)的變化。同時(shí)分析F1代精子總甲基化與F1代GTT曲線(xiàn)下面積及F1代水迷宮逃避潛伏期之間的關(guān)聯(lián)性。
　　結(jié)果：與對(duì)照組F1代大鼠(95.2±0.3％)相比，BPA暴露組的F1代大鼠精子中的DNA總甲基化水平(90.6±0.2％)也發(fā)生了顯著性地降低（p<0.05）。Gck基因的5’端啟動(dòng)子區(qū)域的12個(gè)CpG位點(diǎn)，在BPA暴露組的F1代大鼠精子中全部發(fā)生了