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文檔簡(jiǎn)介
1、本研究旨在探討tmTNF-α對(duì)肥胖誘發(fā)的胰島素抵抗的影響及其分子機(jī)制,為肥胖/胰島素抵抗的干預(yù)和治療提供新的線索。主要結(jié)果如下:
第一部分 外源性tmTNF-α通過TNFR2介導(dǎo)的正向信號(hào)促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性
一、外源性tmTNF-α促進(jìn)3T3-L1及人原代脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性
1.tmTNF-α促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的應(yīng)答。
2.外源性tmTNF-α直接促進(jìn)脂肪細(xì)胞的胰島素信號(hào)通路。<
2、br> 3.外源性tmTNF-α促進(jìn)脂肪細(xì)胞GLUT4的表達(dá)及膜轉(zhuǎn)位。
上述結(jié)果提示tmTNF-α可直接促進(jìn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),提高脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的應(yīng)答。
二、外源性tmTNF-α通過抑制NF-κB通路下調(diào)促炎細(xì)胞因子
1.外源性tmTNF-α抑制NF-κB活化。
2.外源性tmTNF-α通過A20抑制NF-κB通路。
上述結(jié)果提示tmTNF-α通過A20抑制NF-κB活化,從而下調(diào)促炎
3、脂肪細(xì)胞因子IL-6和MCP-1的產(chǎn)生,進(jìn)而間接促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。
三、外源性tmTNF-α通過PPAR-γ促進(jìn)脂肪細(xì)胞表達(dá)胰島素促敏分子脂聯(lián)素
1.外源性tmTNF-α促進(jìn)脂聯(lián)素的產(chǎn)生。
2.外源性tmTNF-α通過PPAR-γ促進(jìn)脂聯(lián)素表達(dá)以及增加胰島素敏感性。
上述結(jié)果提示tmTNF-α通過PPAR-γ促進(jìn)脂聯(lián)素表達(dá),進(jìn)而提高脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。
四、外源性tmT
4、NF-α通過TNFR2發(fā)揮胰島素增敏效應(yīng)
用TNFR1和TNFR2封閉抗體分別預(yù)處理3T3-L1脂肪細(xì)胞,再用兩型TNF-α處理脂肪細(xì)胞24 h,結(jié)果表明:
1.外源性tmTNF-α通過TNFR2促進(jìn)胰島素敏感性;
2.外源性tmTNF-α通過TNFR2下調(diào)炎癥反應(yīng);
3.外源性tmTNF-α通過TNFR2上調(diào)抗炎反應(yīng)。
上述結(jié)果提示tmTNF-α是通過TNFR2提高脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏
5、感性的。
第二部分 tmTNF-α抗體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的影響
一、體外檢測(cè)tmTNF-α抗體的特異性
前期制備了兔抗鼠tmTNF-α多克隆抗體,ELISA檢測(cè)結(jié)果表明:該抗體與tmTNF-α抗原肽產(chǎn)生特異性結(jié)合,而不與sTNF-α發(fā)生交叉反應(yīng);用該抗體與Western Blot分離蛋白染色:只在26kD處檢測(cè)到tmTNF-α,而不能檢測(cè)到17kD的sTNF-α;FACS結(jié)果表明:tmTNF-α抗體可提
6、高3T3-L1細(xì)胞表面tmTNF-α的表達(dá)。
二、確定tmTNF-α抗體治療劑量
為確定tmTNF-α抗體用于體內(nèi)治療的劑量,用不同劑量的抗體腹腔注射C57BL/6小鼠,24小時(shí)后檢測(cè)附睪脂肪及骨骼肌組織中tmTNF-α的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果證明:400μg抗體即可有效增加tmTNF-α在脂肪和骨骼肌組織中的表達(dá);Western blot結(jié)果表明:600μg抗體使脂肪和骨骼肌組織中tmTNF-α的表達(dá)明顯升高。故確
7、定600μg為抗體體內(nèi)的用量。
三、tmTNF-α抗體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠tmTNF-α酶解的影響
高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)2周后,開始給予C57BL/6小鼠兔抗鼠tmTNF-α純化抗體體內(nèi)治療,每周三次,每次600μg經(jīng)腹腔注射,共持續(xù)12周,同時(shí)設(shè)置正常飲食對(duì)照、HFD PBS和HFD IgG對(duì)照。
1.高脂飲食導(dǎo)致肥胖小鼠脂肪組織表達(dá)tmTNF-α輕度增加,但tmTNF-α抗體卻使之表達(dá)明顯增加。
8、r> 2.肥胖小鼠骨骼肌組織表達(dá)tmTNF-α增加,而tmTNF-α抗體卻使之表達(dá)進(jìn)一步增加。
3.肥胖小鼠肝組織表達(dá)tmTNF-α有所增加,而tmTNF-α抗體卻使之表達(dá)進(jìn)一步增加。
4.肥胖導(dǎo)致血漿sTNF-α水平明顯升高,而 tmTNF-α抗體則完全抑制肥胖誘導(dǎo)的sTNF-α分泌。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示tmTNF-α抗體在體內(nèi)可明顯阻斷tmTNF-α被酶解為sTNF-α,使糖代謝重要的脂肪、骨骼肌和肝組
9、織表達(dá)tmTNF-α增加,以便觀察tmTNF-α對(duì)肥胖小鼠糖脂代謝與胰島素抵抗的影響。
四、tmTNF-α抗體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠脂代謝的影響
1.從HFD喂養(yǎng)2周后小鼠體重均明顯高于正常飲食對(duì)照組,且tmTNF-α抗體對(duì)HFD導(dǎo)致體重增長(zhǎng)無影響??贵w治療12周結(jié)束后,抗體治療組與HFD對(duì)照組的體重之間亦無差異。
2.HFD使小鼠脂肪重量明顯增加,tmTNF-α抗體使肥胖小鼠脂肪組織重量進(jìn)一步增加。HFD
10、使小鼠脂肪細(xì)胞體積明顯增大,可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),tmTNF-α抗體組中脂肪細(xì)胞體積更大,但炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。
3.肥胖小鼠肝臟重量明顯增加,肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性,細(xì)胞體積增大,細(xì)胞核周圍出現(xiàn)脂肪空泡,可被油紅O染為紅色,且轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST明顯升高;應(yīng)用tmTNF-α抗體則使肥胖小鼠肝臟重量明顯減輕,肝脂肪變性得到明顯改善,ALT和AST恢復(fù)正常。
4.肥胖小鼠血漿中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、HDL
11、、LDL水平均增高,tmTNF-α抗體可明顯降低肥胖小鼠的TG和LDL水平,進(jìn)一步使HDL水平增高,但對(duì)其高膽固醇血癥無明顯影響。
五、tmTNF-α抗體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠糖代謝的影響
1.肥胖小鼠空腹血糖水平基本正常,然而空腹血漿胰島素水平卻明顯升高;應(yīng)用tmTNF-α抗體可改善肥胖導(dǎo)致的高胰島素血癥,卻使血糖水平進(jìn)一步增高。
2.肥胖小鼠具有明顯的葡萄糖耐量和胰島素耐量的降低,tmTNF-α抗體治療
12、盡管不能改善肥胖小鼠葡萄糖耐量的異常,卻可部分提高胰島素敏感性,提示tmTNF-α抗體導(dǎo)致的高糖血癥主要與胰島素產(chǎn)生相對(duì)不足有關(guān)。
3.肥胖小鼠胰島體積增大、insulin染色陽性細(xì)胞數(shù)量增多,而tmTNF-α抗體治療則明顯抑制肥胖導(dǎo)致胰島代償性肥大以及細(xì)胞代償性增生。進(jìn)一步檢測(cè)證實(shí)tmTNF-α抗體可促進(jìn)胰島tmTNF-α的表達(dá),提示該抗體可能導(dǎo)致胰島細(xì)胞凋亡。TUNEL染色證實(shí)tmTNF-α抗體的確導(dǎo)致胰腺凋亡細(xì)胞增多,這
13、可能是胰島代償不足的原因。
4.肥胖小鼠脂肪和骨骼肌組織膜蛋白中的GLUT4明顯減少,tmTNF-α抗體則明顯促進(jìn)肥胖小鼠脂肪和骨骼肌組織GLUT4在細(xì)胞膜的表達(dá),并誘導(dǎo)肝組織細(xì)胞膜中表達(dá)少量GLUT4。
六、tmTNF-α抗體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠血漿促炎及抗炎細(xì)胞因子的影響
應(yīng)用CBA法檢測(cè)了小鼠血漿中促炎細(xì)胞因子IL-6、MCP-1和抗炎細(xì)胞因子脂聯(lián)素的含量,結(jié)果顯示:肥胖小鼠血漿中IL-6和MCP-
14、1的水平明顯升高,而脂聯(lián)素的水平則明顯下降;tmTNF-α抗體導(dǎo)致上述促炎細(xì)胞因子水平恢復(fù)正常,并完全阻斷肥胖誘導(dǎo)的脂聯(lián)素降低。
第三部分 肥胖患者脂肪組織跨膜型TNF-α轉(zhuǎn)換的特點(diǎn)
一、正常及肥胖病例腹部皮下脂肪組織中TNF-α的表達(dá)
脂肪組織TNF-α的表達(dá)水平與BMI具有正相關(guān)性(r=0.6519,P<0.01)。
二、正常及肥胖病例腹部皮下脂肪組織膜蛋白中tmTNF-α的表達(dá)和脂肪組織勻漿
15、中sTNF-α的分泌
Western Blot和ELISA結(jié)果表明:肥胖病例脂肪組織膜蛋白中tmTNF-α的表達(dá)以及脂肪組織勻漿中sTNF-α的含量均明顯高于正常體重組(p<0.01)。
三、人腹部皮下脂肪組織中TACE的活性與表達(dá)
熒光底物法檢測(cè)人腹部皮下脂肪組織中TACE的活性,用Western Blot檢測(cè)其表達(dá),結(jié)果表明:肥胖病例組脂肪組織中TACE的表達(dá)(p<0.05)及其活性(p<0.01)均明
16、顯高于正常體重組。提示肥胖患者TACE的表達(dá)和活性增高,是tmTNF-α轉(zhuǎn)換增加的分子機(jī)制。
四、人腹部皮下脂肪組織中timp-3的表達(dá)
Western Blot檢測(cè)人腹部皮下脂肪組織中TACE抑制分子timp-3的表達(dá),結(jié)果顯示:肥胖病例組脂肪組織表達(dá)timp-3明顯低于正常體重組(p<0.001)。提示肥胖患者timp-3的低表達(dá)可能是TACE活性增高的原因。
結(jié)論: tmTNF-α可通過TNFR2直接
17、促進(jìn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和GLUT4的表達(dá)與膜轉(zhuǎn)位,促進(jìn)脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖;并通過A20抑制NF-kB活化,進(jìn)而抑制促胰島素抵抗分子IL-6和MCP-1的表達(dá),通過PPAR-γ促進(jìn)胰島素促敏分子脂聯(lián)素的表達(dá),進(jìn)而間接促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。tmTNF-α抗體在體內(nèi)可有效抑制tmTNF-α轉(zhuǎn)換為sTNF-α,使脂肪、骨骼肌、肝和胰腺組織表達(dá)tmTNF-α增加,進(jìn)而改善肥胖誘導(dǎo)的脂代謝異常,發(fā)揮抑炎效應(yīng),部分緩解肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗。但該抗
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