tmTNF-α在肥胖誘導(dǎo)胰島素抵抗中的作用及其機(jī)制.pdf

1、本研究旨在探討tmTNF-α對(duì)肥胖誘發(fā)的胰島素抵抗的影響及其分子機(jī)制，為肥胖/胰島素抵抗的干預(yù)和治療提供新的線索。主要結(jié)果如下：
　　第一部分 外源性tmTNF-α通過TNFR2介導(dǎo)的正向信號(hào)促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性
　　一、外源性tmTNF-α促進(jìn)3T3-L1及人原代脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性
　　1.tmTNF-α促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的應(yīng)答。
　　2.外源性tmTNF-α直接促進(jìn)脂肪細(xì)胞的胰島素信號(hào)通路。<

2、br>　　3.外源性tmTNF-α促進(jìn)脂肪細(xì)胞GLUT4的表達(dá)及膜轉(zhuǎn)位。
　　上述結(jié)果提示tmTNF-α可直接促進(jìn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的應(yīng)答。
　　二、外源性tmTNF-α通過抑制NF-κB通路下調(diào)促炎細(xì)胞因子
　　1.外源性tmTNF-α抑制NF-κB活化。
　　2.外源性tmTNF-α通過A20抑制NF-κB通路。
　　上述結(jié)果提示tmTNF-α通過A20抑制NF-κB活化，從而下調(diào)促炎

3、脂肪細(xì)胞因子IL-6和MCP-1的產(chǎn)生，進(jìn)而間接促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。
　　三、外源性tmTNF-α通過PPAR-γ促進(jìn)脂肪細(xì)胞表達(dá)胰島素促敏分子脂聯(lián)素
　　1.外源性tmTNF-α促進(jìn)脂聯(lián)素的產(chǎn)生。
　　2.外源性tmTNF-α通過PPAR-γ促進(jìn)脂聯(lián)素表達(dá)以及增加胰島素敏感性。
　　上述結(jié)果提示tmTNF-α通過PPAR-γ促進(jìn)脂聯(lián)素表達(dá)，進(jìn)而提高脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。
　　四、外源性tmT

4、NF-α通過TNFR2發(fā)揮胰島素增敏效應(yīng)
　　用TNFR1和TNFR2封閉抗體分別預(yù)處理3T3-L1脂肪細(xì)胞，再用兩型TNF-α處理脂肪細(xì)胞24 h，結(jié)果表明：
　　1.外源性tmTNF-α通過TNFR2促進(jìn)胰島素敏感性；
　　2.外源性tmTNF-α通過TNFR2下調(diào)炎癥反應(yīng)；
　　3.外源性tmTNF-α通過TNFR2上調(diào)抗炎反應(yīng)。
　　上述結(jié)果提示tmTNF-α是通過TNFR2提高脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏

5、感性的。
　　第二部分 tmTNF-α抗體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠的影響
　　一、體外檢測(cè)tmTNF-α抗體的特異性
　　前期制備了兔抗鼠tmTNF-α多克隆抗體，ELISA檢測(cè)結(jié)果表明：該抗體與tmTNF-α抗原肽產(chǎn)生特異性結(jié)合，而不與sTNF-α發(fā)生交叉反應(yīng)；用該抗體與Western Blot分離蛋白染色：只在26kD處檢測(cè)到tmTNF-α，而不能檢測(cè)到17kD的sTNF-α；FACS結(jié)果表明：tmTNF-α抗體可提

6、高3T3-L1細(xì)胞表面tmTNF-α的表達(dá)。
　　二、確定tmTNF-α抗體治療劑量
　　為確定tmTNF-α抗體用于體內(nèi)治療的劑量，用不同劑量的抗體腹腔注射C57BL/6小鼠，24小時(shí)后檢測(cè)附睪脂肪及骨骼肌組織中tmTNF-α的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果證明：400μg抗體即可有效增加tmTNF-α在脂肪和骨骼肌組織中的表達(dá)；Western blot結(jié)果表明：600μg抗體使脂肪和骨骼肌組織中tmTNF-α的表達(dá)明顯升高。故確

7、定600μg為抗體體內(nèi)的用量。
　　三、tmTNF-α抗體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠tmTNF-α酶解的影響
　　高脂飲食（HFD）喂養(yǎng)2周后，開始給予C57BL/6小鼠兔抗鼠tmTNF-α純化抗體體內(nèi)治療，每周三次，每次600μg經(jīng)腹腔注射，共持續(xù)12周，同時(shí)設(shè)置正常飲食對(duì)照、HFD PBS和HFD IgG對(duì)照。
　　1.高脂飲食導(dǎo)致肥胖小鼠脂肪組織表達(dá)tmTNF-α輕度增加，但tmTNF-α抗體卻使之表達(dá)明顯增加。

8、r>　　2.肥胖小鼠骨骼肌組織表達(dá)tmTNF-α增加，而tmTNF-α抗體卻使之表達(dá)進(jìn)一步增加。
　　3.肥胖小鼠肝組織表達(dá)tmTNF-α有所增加，而tmTNF-α抗體卻使之表達(dá)進(jìn)一步增加。
　　4.肥胖導(dǎo)致血漿sTNF-α水平明顯升高，而 tmTNF-α抗體則完全抑制肥胖誘導(dǎo)的sTNF-α分泌。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示tmTNF-α抗體在體內(nèi)可明顯阻斷tmTNF-α被酶解為sTNF-α，使糖代謝重要的脂肪、骨骼肌和肝組

9、織表達(dá)tmTNF-α增加，以便觀察tmTNF-α對(duì)肥胖小鼠糖脂代謝與胰島素抵抗的影響。
　　四、tmTNF-α抗體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠脂代謝的影響
　　1.從HFD喂養(yǎng)2周后小鼠體重均明顯高于正常飲食對(duì)照組，且tmTNF-α抗體對(duì)HFD導(dǎo)致體重增長(zhǎng)無影響?？贵w治療12周結(jié)束后，抗體治療組與HFD對(duì)照組的體重之間亦無差異。
　　2.HFD使小鼠脂肪重量明顯增加，tmTNF-α抗體使肥胖小鼠脂肪組織重量進(jìn)一步增加。HFD

10、使小鼠脂肪細(xì)胞體積明顯增大，可見明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，tmTNF-α抗體組中脂肪細(xì)胞體積更大，但炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。
　　3.肥胖小鼠肝臟重量明顯增加，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞核周圍出現(xiàn)脂肪空泡，可被油紅O染為紅色，且轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST明顯升高；應(yīng)用tmTNF-α抗體則使肥胖小鼠肝臟重量明顯減輕，肝脂肪變性得到明顯改善，ALT和AST恢復(fù)正常。
　　4.肥胖小鼠血漿中總膽固醇(TC)、甘油三酯（TG）、HDL

11、、LDL水平均增高，tmTNF-α抗體可明顯降低肥胖小鼠的TG和LDL水平，進(jìn)一步使HDL水平增高，但對(duì)其高膽固醇血癥無明顯影響。
　　五、tmTNF-α抗體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠糖代謝的影響
　　1.肥胖小鼠空腹血糖水平基本正常，然而空腹血漿胰島素水平卻明顯升高；應(yīng)用tmTNF-α抗體可改善肥胖導(dǎo)致的高胰島素血癥，卻使血糖水平進(jìn)一步增高。
　　2.肥胖小鼠具有明顯的葡萄糖耐量和胰島素耐量的降低，tmTNF-α抗體治療

12、盡管不能改善肥胖小鼠葡萄糖耐量的異常，卻可部分提高胰島素敏感性，提示tmTNF-α抗體導(dǎo)致的高糖血癥主要與胰島素產(chǎn)生相對(duì)不足有關(guān)。
　　3.肥胖小鼠胰島體積增大、insulin染色陽性細(xì)胞數(shù)量增多，而tmTNF-α抗體治療則明顯抑制肥胖導(dǎo)致胰島代償性肥大以及細(xì)胞代償性增生。進(jìn)一步檢測(cè)證實(shí)tmTNF-α抗體可促進(jìn)胰島tmTNF-α的表達(dá)，提示該抗體可能導(dǎo)致胰島細(xì)胞凋亡。TUNEL染色證實(shí)tmTNF-α抗體的確導(dǎo)致胰腺凋亡細(xì)胞增多，這

13、可能是胰島代償不足的原因。
　　4.肥胖小鼠脂肪和骨骼肌組織膜蛋白中的GLUT4明顯減少，tmTNF-α抗體則明顯促進(jìn)肥胖小鼠脂肪和骨骼肌組織GLUT4在細(xì)胞膜的表達(dá)，并誘導(dǎo)肝組織細(xì)胞膜中表達(dá)少量GLUT4。
　　六、tmTNF-α抗體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)肥胖小鼠血漿促炎及抗炎細(xì)胞因子的影響
　　應(yīng)用CBA法檢測(cè)了小鼠血漿中促炎細(xì)胞因子IL-6、MCP-1和抗炎細(xì)胞因子脂聯(lián)素的含量，結(jié)果顯示：肥胖小鼠血漿中IL-6和MCP-

14、1的水平明顯升高，而脂聯(lián)素的水平則明顯下降；tmTNF-α抗體導(dǎo)致上述促炎細(xì)胞因子水平恢復(fù)正常，并完全阻斷肥胖誘導(dǎo)的脂聯(lián)素降低。
　　第三部分 肥胖患者脂肪組織跨膜型TNF-α轉(zhuǎn)換的特點(diǎn)
　　一、正常及肥胖病例腹部皮下脂肪組織中TNF-α的表達(dá)
　　脂肪組織TNF-α的表達(dá)水平與BMI具有正相關(guān)性（r=0.6519，P<0.01）。
　　二、正常及肥胖病例腹部皮下脂肪組織膜蛋白中tmTNF-α的表達(dá)和脂肪組織勻漿

15、中sTNF-α的分泌
　　Western Blot和ELISA結(jié)果表明：肥胖病例脂肪組織膜蛋白中tmTNF-α的表達(dá)以及脂肪組織勻漿中sTNF-α的含量均明顯高于正常體重組（p<0.01）。
　　三、人腹部皮下脂肪組織中TACE的活性與表達(dá)
　　熒光底物法檢測(cè)人腹部皮下脂肪組織中TACE的活性，用Western Blot檢測(cè)其表達(dá)，結(jié)果表明：肥胖病例組脂肪組織中TACE的表達(dá)（p<0.05）及其活性（p<0.01）均明

16、顯高于正常體重組。提示肥胖患者TACE的表達(dá)和活性增高，是tmTNF-α轉(zhuǎn)換增加的分子機(jī)制。
　　四、人腹部皮下脂肪組織中timp-3的表達(dá)
　　Western Blot檢測(cè)人腹部皮下脂肪組織中TACE抑制分子timp-3的表達(dá)，結(jié)果顯示：肥胖病例組脂肪組織表達(dá)timp-3明顯低于正常體重組（p<0.001）。提示肥胖患者timp-3的低表達(dá)可能是TACE活性增高的原因。
　　結(jié)論： tmTNF-α可通過TNFR2直接

17、促進(jìn)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和GLUT4的表達(dá)與膜轉(zhuǎn)位，促進(jìn)脂肪細(xì)胞攝取葡萄糖；并通過A20抑制NF-kB活化，進(jìn)而抑制促胰島素抵抗分子IL-6和MCP-1的表達(dá)，通過PPAR-γ促進(jìn)胰島素促敏分子脂聯(lián)素的表達(dá)，進(jìn)而間接促進(jìn)脂肪細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性。tmTNF-α抗體在體內(nèi)可有效抑制tmTNF-α轉(zhuǎn)換為sTNF-α，使脂肪、骨骼肌、肝和胰腺組織表達(dá)tmTNF-α增加，進(jìn)而改善肥胖誘導(dǎo)的脂代謝異常，發(fā)揮抑炎效應(yīng)，部分緩解肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗。但該抗