BAG3抑制埃博拉病毒和馬爾堡病毒VLP出芽及其機(jī)制探索.pdf

1、埃博拉病毒屬(ebolavirus，EBOV)與馬爾堡病毒屬(marburgvirus，MARY)同屬于絲狀病毒科filoviridae），能夠?qū)е氯祟惻c靈長類動物的嚴(yán)重病毒性出血熱，是感染死亡率極高的人獸共患病病原。目前尚沒有公認(rèn)的疫苗或藥物能夠確實地預(yù)防和治療EBOV和MARV的感染。2014-2016年中非、西非國家暴發(fā)的嚴(yán)重埃博拉疫情及一些歐美國家的零星散發(fā)病例使得這一致命病原再次受到廣泛關(guān)注。絲狀病毒對全球公共衛(wèi)生安全的威脅不

2、斷，深入探索該病毒生物學(xué)特性與致病機(jī)理的重要性尤為凸顯。
　　病毒侵入細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制循環(huán)后，子代病毒需要從宿主細(xì)胞釋放，進(jìn)而感染其他細(xì)胞而進(jìn)行傳播。絲狀病毒的出芽釋放是病毒生命周期的重要階段，也是其傳播、致病的必要環(huán)節(jié)。本研究旨在了解與闡明哪些宿主蛋白、哪些細(xì)胞進(jìn)程（正/負(fù)）調(diào)控了絲狀病毒EBOV、MARV病毒粒子的出芽釋放過程。
　　絲狀病毒基質(zhì)蛋白VP40是負(fù)責(zé)病毒粒子裝配與出芽的關(guān)鍵成分，在哺乳動物細(xì)胞中，該蛋白能夠獨立

3、地裝配成形態(tài)上與感染性病毒粒子相似的病毒樣顆粒(Virus like particle，VLP)，并模擬活病毒出芽的方式從細(xì)胞中釋放。絲狀病毒EBOV與MARV的VP40蛋白介導(dǎo)的自我裝配為VLP并出芽釋放的這一特性，為深入了解病毒出芽機(jī)制提供了可靠的研究手段。
　　VP40蛋白的晚期出芽結(jié)構(gòu)域(Late budding domain，L-domain)是介導(dǎo)VLP與病毒粒子出芽的關(guān)鍵功能區(qū)域。PPxY、P(T/S)AP、YPx(

4、n)L等由4個（及以上）氨基酸殘基構(gòu)成的“基序”(motif)為L-domain的重要功能元件。L-domain基序能夠與不同的宿主蛋白結(jié)合，“挾持”這些蛋白與相關(guān)的宿主細(xì)胞機(jī)制來共同完成病毒的出芽釋放。EBOV和MARV的VP40蛋白均攜帶L-domain基序PPxY，該基序為WW domain的典型配體之一，而WW domain是廣泛存在于宿主蛋白上的、介導(dǎo)蛋白間相互作用的功能模塊。因此，VP40蛋白能夠通過PPxY基序與攜帶WW

5、domain的宿主蛋白結(jié)合。例如，VP40PPxY基序通過結(jié)合HECT E3泛素連接酶Nedd4和ITCH蛋白的WW domain而對它們進(jìn)行招募，介導(dǎo)自身的泛素化并促進(jìn)病毒粒子和VLP的出芽。
　　為了鑒定出更多的、能夠與VP40PPxY基序結(jié)合的、含WW domain的宿主蛋白，本研究首先構(gòu)建了由115個蛋白WW domain組成的PPxY“脯氨酸富集”基序閱讀陣列，利用含EBOV VP40L-domain基序的肽段“掃描”該

6、陣列，成功鑒定出多個能夠與PPxY基序發(fā)生特異性反應(yīng)的宿主蛋白WW domain，如Bcl-2相關(guān)永生基因3(Bcl-2associated athanogene3，BAG3)蛋白。本研究利用GST-Pulldown與免疫共沉淀等方法驗證了BAG3蛋白與EBOV、MARVVP40蛋白在體外及細(xì)胞內(nèi)的相互結(jié)合，并通過突變體實驗證實該相互作用依賴于BAG3的WW domain與VP40的PPxY基序之間的相互作用機(jī)制。
　　EBOV

7、VP40L-domain基序在“PPxY”閱讀陣列中只能結(jié)合部分宿主蛋白WW domain，說明PPxY—WW domain的相互作用同時具備特異性與選擇性。由于VP40蛋白的關(guān)鍵功能是介導(dǎo)病毒粒子出芽，本研究為評估BAG3-VP40間高度選擇性和特異性的相互作用可能具有的特定生物學(xué)意義，利用了VLP出芽實驗測定BAG3對VP40出芽過程的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BAG3蛋白能夠以劑量依賴性的方式抑制VP40所介導(dǎo)的VLP出芽，降低細(xì)胞內(nèi)源性的

8、BAG3蛋白表達(dá)能夠增加VLP的產(chǎn)量。BAG3與之前鑒定的全部含WW domain宿主蛋白不同，它并非被VP40“挾持”來促進(jìn)病毒的出芽，而是表現(xiàn)出抑制病毒出芽的能力。BAB3的抑制出芽功能也需要依賴PPxY—WW domain之間的相互作用。實驗還證實，BAG3能夠阻礙攜帶EBOV VP40L-domain基序的感染性重組病毒VSV-M40從細(xì)胞中釋放，說明BAG3對出芽的負(fù)調(diào)控不僅作用于VLP的出芽，也能夠抑制感染性病毒粒子的出芽釋

9、放。
　　BAG3是共-分子伴侶蛋白BAG家族的成員，能夠調(diào)節(jié)多種關(guān)鍵的細(xì)胞生理進(jìn)程。作為一種細(xì)胞壓力應(yīng)激誘導(dǎo)的促細(xì)胞存活蛋白，BAG3具有抗細(xì)胞凋亡與促細(xì)胞自噬的活性，參與分子伴侶相關(guān)的選擇性自噬(selective autophagy)進(jìn)程，能夠?qū)㈠e誤折疊蛋白或外源蛋白扣押入細(xì)胞聚集體(aggresome)中，利于下游自噬—溶酶體系統(tǒng)對這些靶標(biāo)蛋白進(jìn)行降解，協(xié)助維持細(xì)胞內(nèi)蛋白穩(wěn)態(tài)。
　　為了探明BAG3通過何種機(jī)制抑制V

10、P40介導(dǎo)的VLP出芽，本研究通過活細(xì)胞共聚焦顯微鏡成像實驗，發(fā)現(xiàn)BAG3能夠顯著改變VP40在細(xì)胞內(nèi)的定位，導(dǎo)致VP40不能聚集到細(xì)胞外緣區(qū)域，無法形成胞膜突觸。利用細(xì)胞組分分離技術(shù)與雙染色間接免疫熒光實驗，證實BAG3能夠?qū)P40滯留在細(xì)胞漿內(nèi)，阻止VP40定位到細(xì)胞膜上的出芽位點，從而抑制VP40所介導(dǎo)的VLP裝配與出芽。最關(guān)鍵的是，BAG3能夠?qū)е乱徊糠值腣P40蛋白扣押在細(xì)胞核周邊區(qū)域的聚集體中，該聚集體攜帶細(xì)胞自噬體的標(biāo)志

11、蛋白LC3-Ⅱ，表明BAG3的促細(xì)胞自噬和分子伴侶相關(guān)選擇性自噬活性參與了對VLP出芽的抑制機(jī)制。實驗還證實，BAG3可以競爭性地阻礙VP40與其他促病毒出芽的WW domain宿主蛋白(如Nedd4、ITCH)的結(jié)合，這一特性也可能參與了BAG3對VLP出芽的負(fù)調(diào)控機(jī)制。
　　綜上所述，本研究成功鑒定出BAG3蛋白為絲狀病毒EBOV與MARVVP40的互作宿主蛋白，能夠抑制VP40VLP的出芽和感染性重組病毒的釋放。作為首個被發(fā)