Viperin抑制狂犬病病毒機(jī)理的探索研究.pdf

1、Viperin是一種干擾素誘導(dǎo)蛋白，可通過完全不同的機(jī)制對多種病毒發(fā)揮抗病毒活性。先前的研究沒有viperin抑制狂犬病病毒(RABV)復(fù)制的報道。通?？袢〔《驹谄湟赘屑?xì)胞中生長良好，具有較高的病毒滴度。最近我們的研究中發(fā)現(xiàn)，狂犬病病毒在巨噬細(xì)胞RAW264.7中生長緩慢，病毒滴度顯著地低于易感細(xì)胞（如NA細(xì)胞）。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，狂犬病病毒感染易感的NA細(xì)胞時，viperin表達(dá)微弱或不表達(dá)，但感染巨噬細(xì)胞時viperin被顯著誘導(dǎo)

2、表達(dá)。
　　本研究為了探索抗病毒蛋白viperin的表達(dá)是否抑制狂犬病病毒的復(fù)制，我們構(gòu)建了viperin的真核表達(dá)載體，通過瞬時轉(zhuǎn)染BSR-T7細(xì)胞，過表達(dá)viperin，證實了過表達(dá)viperin能抑制狂犬病病毒rRC-HL的復(fù)制，在一定范圍內(nèi)狂犬病病毒N、P和M蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)量明顯被抑制，狂犬病病毒滴度顯著降低。通過篩選穩(wěn)定表達(dá)viperin的BHK-21細(xì)胞系，感染狂犬病病毒，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)viperin的BHK-21細(xì)

3、胞系對狂犬病病毒rRC-HL株的抑制效果更加明顯，顯著抑制了病毒蛋白的合成。同樣穩(wěn)定表達(dá)viperin的BHK-21細(xì)胞系顯著抑制廣西分離強(qiáng)毒Ⅰ群和Ⅲ群代表株GX01和GXN119。
　　在此基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步探索viperin抑制狂犬病病毒主要功能區(qū)域，本實驗構(gòu)建了缺失viperin N末端兩親性的a螺旋區(qū)域及突變S-腺苷甲硫胺酸酶基序的突變體，測定這些突變體抑制狂犬病病毒的效果，結(jié)果顯示viperin的抑制狂犬病病毒復(fù)制活性區(qū)

4、域主要位于其N末端，其突變后抗狂犬病病毒能力顯著下降。S-腺苷甲硫胺酸酶基序的3個關(guān)鍵氨基酸(C83A/C87A/C90A)突變后，其抑制狂犬病病毒的能力也明顯下降。
　　先前的研究發(fā)現(xiàn)viperin的N末端可結(jié)合細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及脂滴，擾亂細(xì)胞膜的脂筏結(jié)構(gòu)來抑制病毒的出芽與釋放。為了探索viperin抑制狂犬病病毒復(fù)制的機(jī)理，本實驗就viperin對脂筏的重要組成成分膽固醇和鞘磷脂的生物學(xué)作用進(jìn)行探索。首先在BSR-T7細(xì)胞中過表達(dá)

5、viperin，檢測細(xì)胞中膽固醇和鞘磷脂變化情況。結(jié)果顯示，過表達(dá)viperin能夠降低細(xì)胞中膽固醇和鞘磷脂的含量，推測viperin可能通過破壞膽固醇和鞘磷脂以抑制狂犬病病毒釋放。同時添加分別抑制膽固醇和鞘磷脂的藥物Mβ CD和Myroicin，發(fā)現(xiàn)破壞細(xì)胞的膽固醇和鞘磷脂對狂犬病病毒的吸附與穿入無影響，但對狂犬病病毒的出芽與釋放有抑制作用，證實了破壞細(xì)胞的膽固醇和鞘磷脂是viperin抑制狂犬病病毒復(fù)制的重要途徑之一。
　　V

6、iperin是干擾素誘導(dǎo)蛋白，受干擾素的誘導(dǎo)和調(diào)控，本實驗進(jìn)一步探索狂犬病病毒感染巨噬細(xì)胞上調(diào)viperin基因的上游信號傳導(dǎo)通路，應(yīng)用芯片技術(shù)對狂犬病病毒感染RAW264.7細(xì)胞后，84個免疫應(yīng)答基因及幾個主要看家基因轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，狂犬病病毒感染巨噬細(xì)胞后12、24和36 h三個時間點都上調(diào)2倍以上的基因共有26個;12h上調(diào)2倍以上、24和36 h無明顯變化的基因有2個;12和24 h上調(diào)2倍以上、36 h無明顯變化的

7、基因有1個;12h無變化、24和36 h上調(diào)2倍以上的基因有15個;12和24 h無變化、36 h上調(diào)2倍以上的基因有17個;12、24和36 h三個時間點都沒有明顯變化（小于2倍）的基因有25個;12、24和36 h三個時間點都下調(diào)2倍以上的基因有1個。其中，Cxcl10基因在12、24和36 h三個時間點上調(diào)倍數(shù)分別為377.85、333.14和183.12倍;IFNβ基因分別為370.07、68.12和13.09倍?？袢〔《靖腥?/p>

8、RAW264.7細(xì)胞也會引起TLRs不同程度升高，TLR3基因分別為156.68、380.03和164.66倍，TLR2和TLR8基因呈一定程度的上調(diào)表達(dá)，TLR1、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7和TLR9也有較顯著的變化。
　　上述實驗證明TLRs參與了狂犬病病毒感染RAW264.7細(xì)胞的免疫信號傳導(dǎo)。根據(jù)TLR4能夠識別病毒的囊膜蛋白傳遞免疫信號和激活機(jī)體固有免疫、TLR3識別雙鏈RNA(dsRNA)和病毒復(fù)制過程中產(chǎn)

9、生的中間復(fù)合物的特性，本研究使用流式細(xì)胞術(shù)證明了巨噬細(xì)胞感染狂犬病病毒后，顯著上調(diào)TLR4的表達(dá)，說明狂犬病病毒激活了TLR4;然而再用滅活的狂犬病病毒孵育巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)保留了基本自然特性的狂犬病病毒囊膜糖蛋白能夠誘導(dǎo)viperin的表達(dá)。進(jìn)一步用TLR4的特異性抑制劑(TAK-242)阻斷TLR4信號的傳導(dǎo)，顯示viperin的表達(dá)量顯著減少，說明TLR4參與了識別狂犬病病毒并誘導(dǎo)viperin表達(dá)。為了驗證TLR3與狂犬病病毒相互作

10、用及其誘導(dǎo)viperin表達(dá)的固有免疫反應(yīng)，本實驗首先構(gòu)建了TLR3基因敲除的TLR3-/-RAW264.7細(xì)胞系，感染狂犬病病毒，檢測viperin蛋白的變化情況，顯示敲除了TLR3基因的TLR3-/-RAW264.7細(xì)胞可顯著推遲并減少viperin蛋白表達(dá)量，說明TLR3參與識別狂犬病病毒核酸并誘導(dǎo)viperin的表達(dá)。
　　NF-κB和IRF3是固有免疫信號通路中兩個重要的免疫因子，用NF-κB的特異性抑制劑抑制其通路的信

11、號傳導(dǎo)，然后感染狂犬病病毒，結(jié)果顯示抑制NF-κB通路的信號傳導(dǎo)，viperin的表達(dá)量幾乎不受影響，說明狂犬病病毒上調(diào)viperin與NF-κB信號通路沒有直接關(guān)聯(lián)性。用IRF3的特異性抑制劑格爾德霉素抑制處理細(xì)胞后，可抑制IRF3的分子伴侶Hsp90，使viperin的表達(dá)時間推遲并減少表達(dá)量，說明IRF3參與了狂犬病病毒誘導(dǎo)viperin表達(dá)的調(diào)控。
　　綜上所述，狂犬病病毒感染巨噬細(xì)胞RAW264.7可誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)蛋白v

12、iperin表達(dá)，viperin表達(dá)具有抑制狂犬病強(qiáng)毒、弱毒復(fù)制的作用。這種抑制作用主要通過破壞RAW264.7細(xì)胞膜的膽固醇和鞘磷脂，阻礙病毒的出芽和釋放。進(jìn)一步的芯片技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞RAW264.7感染狂犬病病毒時多數(shù)TLRs的表達(dá)受到影響。當(dāng)用狂犬病病毒感染敲除TLR3基因的TLR3-/-RAW264.7細(xì)胞，viperin的表達(dá)量比正常RAW264.7細(xì)胞顯著減少并延后;用TLR4抑制劑TAK-242可抑制狂犬病病毒誘導(dǎo)v