線蟲特定神經(jīng)元的轉(zhuǎn)基因表達(dá).pdf

1、相對(duì)于其它模式生物，線蟲神經(jīng)系統(tǒng)比較簡(jiǎn)單，雌雄同體成蟲只有302個(gè)神經(jīng)元--這些神經(jīng)元可以分為：運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、感覺(jué)神經(jīng)元、中間神經(jīng)元等幾大類。但是在如此少的神經(jīng)元之間卻形成了非常復(fù)雜的聯(lián)系。這些聯(lián)系中，主要包括大約5000個(gè)化學(xué)突觸，2000個(gè)神經(jīng)肌肉接頭和600個(gè)間隙連接。部分神經(jīng)元和突觸連接關(guān)系已經(jīng)通過(guò)連續(xù)切片的電鏡圖片重組技術(shù)研究清楚。
　　 基于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、基因組完成測(cè)序等許多優(yōu)點(diǎn)，線蟲已經(jīng)被用作科學(xué)研究的模式生物。為了更好

2、的體現(xiàn)線蟲的研究?jī)r(jià)值并為線蟲研究者提供更多有利的條件，本課題致力于標(biāo)記線蟲神經(jīng)元，即確定各個(gè)神經(jīng)元的位置并進(jìn)行部分功能研究。雖然定位技術(shù)多種多樣，但是可用來(lái)標(biāo)記單個(gè)神經(jīng)元的技術(shù)卻屈指可數(shù)，因?yàn)榫€蟲基因表達(dá)譜一般都比較廣，特定表達(dá)于某個(gè)細(xì)胞的啟動(dòng)子比較少，所以本課題采用多種位點(diǎn)專一重組酶系統(tǒng)（FLP/FRT，Gateway）的分子生物學(xué)方法與激光共聚焦顯微成像技術(shù)相結(jié)合的方法來(lái)定位線蟲神經(jīng)元。線蟲大部分的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光蛋白表達(dá)都具有交叉重

3、疊的現(xiàn)象，運(yùn)用不同顏色的熒光蛋白的表達(dá)使重疊的部位顯示出不同于單個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光蛋白表達(dá)時(shí)熒光的顏色，由此可以標(biāo)記單個(gè)神經(jīng)元。在準(zhǔn)確定位神經(jīng)元后，使光控蛋白（Channelrhodopsin-2，ChR2; Natronomonas pharaonis halorhodopsin，NpHR）、Ca2+指示蛋白（GFP-Calmodulin Protein，G-CaMP）、凋亡蛋白（CED-3）特異表達(dá)于目標(biāo)神經(jīng)元可以更好的進(jìn)行神經(jīng)元在整

4、個(gè)神經(jīng)回路中功能的研究。
　　 很多體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)基因的應(yīng)用需要多個(gè)異源基因的共表達(dá)，而第二種反式剪接的spliced leader (SL2)在多順?lè)醋颖磉_(dá)載體中的運(yùn)用可以在同一個(gè)啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下使多個(gè)報(bào)告基因在特定的細(xì)胞或組織中表達(dá)。本課題選擇SL2連接不同個(gè)數(shù)的順?lè)醋硬⒃谔囟ǖ膯?dòng)子的驅(qū)動(dòng)下表達(dá)，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)、生化技術(shù)與激光掃描共聚焦成像技術(shù)得到了以下結(jié)論：多個(gè)串聯(lián)的SL2不會(huì)影響各個(gè)基因的表達(dá)；多個(gè)GFP串聯(lián)時(shí)，GF