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1、ADH I是人肝臟中表達(dá)量最多的一類(lèi)乙醇脫氫酶同工酶,表現(xiàn)出很高的乙醇氧化活性,是乙醇氧化代謝的關(guān)鍵酶之一;有報(bào)道稱ADH I不僅可以催化乙醇脫氫生成乙醛,還可以通過(guò)歧化作用將乙醛轉(zhuǎn)化成乙酸,是一種不會(huì)產(chǎn)生毒性氧化物的解毒酶。對(duì)人ADH同工酶的動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn),ADH1B2編碼的β2β2-ADH在乙醇氧化反應(yīng)中具有低Km高Vmax的特點(diǎn),是乙醇氧化的高效酶。因此本文將人肝臟來(lái)源的ADH1B2基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌、畢赤酵母和肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá),分析其
2、活性,并探討其在乙醇導(dǎo)致的細(xì)胞損傷中的作用。
以實(shí)驗(yàn)室保存的pUCm-T-adh為模板,擴(kuò)增獲得ADH1B2基因,測(cè)序正確后與表達(dá)載體連接獲得pET-32a-ADH1B2質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后獲得了高效表達(dá),但是以包涵體形式表達(dá)的酶蛋白沒(méi)有活性。故構(gòu)建pPIC9K-ADH1B2、pPICZB-ADH1B2質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,pPICZB-ADH1B2轉(zhuǎn)化得到的陽(yáng)性克隆內(nèi)表達(dá)可溶性ADHI,細(xì)胞破碎后離心上
3、清具有酶活性。經(jīng)DEAE-Sepharose FF柱層析純化后獲得酶蛋白,并分析其酶活性。同時(shí)構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDNA3.1-ADH1B2轉(zhuǎn)染HepG2人肝癌細(xì)胞和LO2人正常肝細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ADH1B2基因?qū)е翲epG2細(xì)胞內(nèi)ROS水平下降,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Akt蛋白磷酸化水平下降,抑制細(xì)胞活性。同時(shí)將ADH1B2基因轉(zhuǎn)染LO2細(xì)胞,可抑制酒精引起的細(xì)胞活性下降。
本文利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)獲得了具有活性的ADH I酶蛋白
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