結(jié)締組織生長因子(CTGF)對人牙周膜成纖維細(xì)胞生物學(xué)活性的影響.pdf

1、全世界牙周病的發(fā)病率約為10％～15％。最新結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示，在我國及日本30歲以上人群中有約80％人患牙周病[1]。牙周病成為35歲以上人群牙齒缺失的主要原因，并已成為多種慢性系統(tǒng)性疾?。ㄈ绻谛牟?、糖尿病等）發(fā)生、發(fā)展的危險(xiǎn)因素，嚴(yán)重威脅著人類的健康[2]。牙周病治療的最終目標(biāo)是重建因炎癥過程而破壞的牙周組織，恢復(fù)其正常的結(jié)構(gòu)和功能，即真正實(shí)現(xiàn)牙周組織的再生。但因牙周病喪失的牙周組織，其重建與修復(fù)的難度很大。多年來，人們一直在尋求能有效增

2、加牙周新附著、促進(jìn)牙周組織再生的方法，并開展了引導(dǎo)牙周組織再生、牙周骨移植技術(shù)等多方面的研究，取得了一定進(jìn)展，但在恢復(fù)牙周組織的生理結(jié)構(gòu)和功能上還遠(yuǎn)遠(yuǎn)未達(dá)到所期望的目標(biāo)。近年來，組織工程、干細(xì)胞及其相關(guān)技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn)，采用組織工程技術(shù)再生組織或者器官的研究也方興未艾，這為牙周組織再生研究提供了契機(jī)。組織工程學(xué)的研究重點(diǎn)主要在于以下三個方面:(1)種子細(xì)胞的來源;(2)生物載體支架材料的選擇;(3)有效的細(xì)胞因子。所以選擇有效的細(xì)胞因

3、子是運(yùn)用組織工程技術(shù)獲得牙周再生的先決條件。
　　結(jié)締組織生長因子(CTGF)是近年來出現(xiàn)的一類促進(jìn)組織修復(fù)的細(xì)胞生長因子，可以促進(jìn)有絲分裂和細(xì)胞增殖，趨化細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞黏附和細(xì)胞外基質(zhì)的合成。已經(jīng)在眼科、肝腎等學(xué)科中進(jìn)行了深入研究，但在口腔科中很少涉及。牙周支持組織中也含有大量的纖維組織，牙周膜成纖維細(xì)胞是牙周組織中最重要的功能細(xì)胞，而CTGF與牙周組織的成纖維細(xì)胞的關(guān)系研究很少。
　　本課題選取人雙尖牙根中1/3的牙周膜

4、組織進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過組織塊培養(yǎng)法提取人牙周膜成纖維細(xì)胞，提取成功后用結(jié)締組織生長因子作用于成纖維細(xì)胞，觀察對其生物學(xué)活性的影響，從而為口腔科治療牙周病提供新的研究方向，為牙周病臨床藥物的研發(fā)提供新的生長因子。
　　目的:
　　體外培養(yǎng)人牙周膜成纖維細(xì)胞作為研究對象，觀察不同濃度的結(jié)締組織生長因子(CTGF)對人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖、分化、黏附、遷移、合成細(xì)胞外基質(zhì)的影響，探討不同濃度的結(jié)締組織生長因子(CTGF)對人牙周膜

5、成纖維細(xì)胞的生物學(xué)變化及其意義，為牙周組織再生的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1、在體外利用組織塊培養(yǎng)法分離純化人牙周膜成纖維細(xì)胞，倒置相差顯微鏡和蘇木素-伊紅染色觀察細(xì)胞形態(tài)，繪制細(xì)胞生長曲線，對細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。
　　2、應(yīng)用CCK-8方法檢測不同濃度的結(jié)締組織生長因子(1、5、10、50、100ng/ml)作用于人牙周膜成纖維細(xì)胞24、48、72h后增殖活性的影響。
　　3、應(yīng)用堿性磷酸酶

6、試劑盒檢測不同濃度的結(jié)締組織生長因子(1、5、10、50、100ng/ml)對人牙周膜成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶活性的影響。
　　4、應(yīng)用羥脯氨酸試劑盒檢測不同濃度的結(jié)締組織生長因子(1、5、10、50、100ng/ml)對人牙周膜成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白的影響。
　　5、應(yīng)用茜素紅染色法檢測不同濃度的結(jié)締組織生長因子(1、5、10、50、100ng/ml)對人牙周膜成纖維細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)能力的影響。
　　6、應(yīng)用Transw

7、ell小室檢測不同濃度的結(jié)締組織生長因子(1、5、10、50、100ng/ml)對人牙周膜成纖維細(xì)胞遷移能力的影響。
　　7、應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測不同濃度的結(jié)締組織生長因子(1、5、10、50、100ng/ml)對人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）、堿性磷酸酶(ALP)、纖維連接蛋白(FN)、骨涎蛋白(IBSP)、骨鈣素(OC)、整合素β1(ITGB1)mRNA水平的影響。
　　所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPS

8、S20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，以P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、在體外采用組織塊培養(yǎng)法成功獲取人牙周膜成纖維細(xì)胞。細(xì)胞形態(tài)正常，形狀穩(wěn)定，狀態(tài)良好。免疫細(xì)胞化學(xué)染色波形絲蛋白陽性，角蛋白陰性，符合中胚層來源的間充質(zhì)細(xì)胞的特征，證明培養(yǎng)的細(xì)胞是人牙周膜成纖維細(xì)胞。細(xì)胞生長曲線呈現(xiàn)“S”形。處于對數(shù)生長期的人牙周膜成纖維細(xì)胞，活性最佳，生長旺盛，最適合用于實(shí)驗(yàn)研究。

9、本實(shí)驗(yàn)取第4～6代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、與對照組相比，1、5、10ng/ml的CTGF在24、48、72h對人牙周膜成纖維細(xì)胞有明顯的促增殖作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而50ng/ml的CTGF與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，100ng/ml的CTGF則對人牙周膜成纖維細(xì)胞有抑制作用。兩兩比較顯示，不同濃度的CTGF刺激人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖在三個不同的時(shí)間點(diǎn)之間，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.0

10、5)。10ng/ml為促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的最佳濃度。
　　3、與對照組相比，1、5、10、50ng/ml的CTGF在7、14、28d對人牙周膜成纖維細(xì)胞有顯著增強(qiáng)ALP活性的作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，100ng/ml的CTGF則對人牙周膜成纖維細(xì)胞ALP活性有抑制作用。兩兩比較顯示，不同濃度的CTGF增強(qiáng)人牙周膜成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶的活性在三個不同的時(shí)間點(diǎn)之間，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。10ng/

11、ml的CTGF為促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶活性的最佳濃度。
　　4、與對照組相比，1、5、10ng/ml的CTGF對人牙周膜成纖維細(xì)胞有顯著增強(qiáng)膠原蛋白合成的作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，50、100ng/ml的CTGF與對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。10ng/ml的CTGF為促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白的最佳濃度。
　　5、6個實(shí)驗(yàn)組之間礦化率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

12、，與對照組相比，在質(zhì)量濃度10ng/ml時(shí)，CTGF具有最大的促礦化作用(P＜0.01)。
　　6、1～100ng/ml的結(jié)締組織生長因子可以明顯促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞遷移，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。細(xì)胞遷移能力隨著結(jié)締組織生長因子(CTGF)濃度的增高而增加，表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。
　　7、RT-PCR結(jié)果顯示，細(xì)胞ALP的mRNA表達(dá)水平，在CTGF濃度為5、10、50ng/ml時(shí)可以促進(jìn)ALPmRNA的表達(dá)

13、，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在10ng/ml時(shí)達(dá)到最高峰。而1ng/ml和100ng/ml時(shí)與對照組相比差別不大。細(xì)胞IBSP的mRNA表達(dá)水平，在CTGF濃度為1、10、50、100ng/ml時(shí)可以促進(jìn)IBSPmRNA的表達(dá)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在10ng/ml時(shí)達(dá)到最高峰。而5ng/ml時(shí)與對照組相比差別不大。細(xì)胞OC的mRNA表達(dá)水平，在CTGF濃度為1、10、50ng/ml時(shí)

14、，可以促進(jìn)OCmRNA的表達(dá)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在10ng/ml時(shí)達(dá)到最高峰。而5ng/ml和100ng/ml時(shí)與對照組相比差別不大。細(xì)胞FN、COL-Ⅰ的mRNA表達(dá)水平，當(dāng)CTGF在一定的濃度范圍(1～100ng/ml)內(nèi)可以促進(jìn)FN、COL-Ⅰ的mRN的表達(dá)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在10ng/ml時(shí)達(dá)到最高峰。細(xì)胞ITGB1的mRNA表達(dá)水平，在CTGF濃度為1、5、10

15、、50ng/ml時(shí)可以促進(jìn)ITGB1mRNA的表達(dá)，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，在10ng/ml時(shí)達(dá)到最高峰。而100ng/ml時(shí)與對照組相比差別不大。
　　結(jié)論:
　　1、在體外采用組織塊培養(yǎng)法可以成功獲取人牙周膜成纖維細(xì)胞。該方法簡單易行，結(jié)果可靠，可以作為體外人牙周膜成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究模型。
　　2、結(jié)締組織生長因子作用于人牙周膜成纖維細(xì)胞以后，能夠提高人牙周成纖維細(xì)胞的活性，通過提高整合