血紅素氧合酶-1表達保護復蘇后心肌損傷的實驗研究.pdf

1、院外心臟驟?；颊叱跏夹姆螐吞K(Cardiopulmonary resuscitation，CPR)成功率約為40％，但大部分初始復蘇成功的患者死于復蘇后72小時內，心跳驟?；颊咝姆螐吞K后最終僅有約1.4％—5％能夠生理功能相對正常存活。復蘇后心功能不全是初期復蘇成功后數小時、數天高致死率的重要原因。保護心跳驟停全心缺血再灌注損傷的心肌，救治復蘇后心功能不全，最終改善心肺復蘇預后是急診醫(yī)學研究的重要課題。多種疾病的發(fā)生發(fā)展都是致傷和抗損傷

2、因素相互作用的過程，既往復蘇后心功能不全的干預手段多側重于減輕致損傷因素，而對于全身缺血再灌注損傷應激下的機體內源性保護機制較少涉及。 近些年來，在器官保護領域的研究中血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)備受關注。HO-1是血紅素分解代謝的關鍵限速酶，產生三種重要產物膽紅素、一氧化碳(CO)和Fe2+，具有抗氧化、抗炎癥、抗凋亡等多重保護效應。多種具有氧化應激性質的刺激可誘導其表達，HO-1拮抗細胞應激

3、，維持機體穩(wěn)態(tài)，是重要的內源性防御保護系統(tǒng)，已在器官移植等領域顯示明確保護效應。復蘇后心功能不全是獨特的全身缺血再灌注背景下發(fā)生的心肌損傷，可否通過扶持HO-1內源性防御保護系統(tǒng)，增強機體的抗損傷、抗應激能力，從而保護復蘇后心肌不得而知。本研究設想誘導HO-1過表達，探討其對心肺復蘇大鼠缺血再灌注損傷的心肌及體外培養(yǎng)心肌細胞缺氧再復氧損傷的保護作用，并初步闡述其發(fā)揮保護效應的機制。 第一部分血紅素氧合酶-1對心肺復蘇大鼠心肌缺血

4、 再灌注損傷的保護作用研究 研究目的： 建立大鼠心跳驟停-心肺復蘇動物模型，給予血紅素氧合酶-1(HO-1)誘導劑血晶素(Hemin)和抑制劑鋅原卟琳(ZnPP)，研究HO-1在心肺復蘇大鼠心肌的表達對復蘇中心肌缺血再灌注損傷的影響，并從炎癥因子釋放和氧化/抗氧化角度對HO-1在復蘇后心肌損傷中的可能作用機制作一探討。 材料和方法： 建立窒息法致大鼠心跳驟停-心肺復蘇動物模型，應用HO-1誘導劑H

5、emin和抑制劑ZnPP預處理心肺復蘇大鼠，設假手術組、CPR組、Hemin組和Hemin+ZnPP組四個實驗組，每組分復蘇后6h和24h兩個亞組。采用蛋白免疫印跡和免疫組化方法檢測大鼠心肌HO-1蛋白表達水平；監(jiān)測大鼠復蘇后4h內的血流動力學；觀察大鼠復蘇后心肌酶學指標及心肌超微結構變化。分別采用硫代巴比妥酸法、黃嘌呤氧化法測定復蘇大鼠心肌組織勻漿丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，ELISA法檢測大鼠復蘇后血清腫瘤壞死因

6、子—α(TNF-α)和白細胞介素—6(IL—6)水平。免疫組化方法檢測大鼠復蘇后心肌硝基硌氨酸蛋白表達。 結果： 1、大鼠復蘇后心肌HO-1表達 較假手術組比較，CPR組HO-1蛋白表達明顯升高，Hemin進一步誘導HO-1表達，ZnPP可抑制HO-1表達。 2、大鼠復蘇后心功能比較 CPR組復蘇后反映心室收縮功能和舒張功能的dP/dt40、—dP/dt均顯著低于復蘇前，Hemin組dP/dt4

7、0復蘇后無顯著性變化，—dP/dt復蘇后短暫降低，2h后恢復至復蘇前水平。Hemin組復蘇后各時相dP/dt40、—dP/dt均高于CPR組和Hemin+ZnPP組。 3、大鼠復蘇后心肌酶學變化 CPR組復蘇后血清LDH、CPK—MB明顯升高，復蘇后6 h及24 h時相亞組，Hemin組CPK—MB、LDH值均低于CPR組及Hemin+ZnPP組。后兩組之間，復蘇后心肌酶水平無顯著性差異。 4、各組復蘇后6h心

8、肌超微結構的變化 CPR組復蘇后心肌線粒體腫脹、灶性空化，嵴模糊不清，肌節(jié)結構模糊。Hemin組僅少部分線粒體輕微水腫，嵴清晰，肌絲清晰，復蘇后心肌超微結構完整性明顯優(yōu)于CPR組。ZnPP抑制HO-1表達后，心肌損傷加重。 5、大鼠復蘇后血清炎癥因子變化 與假手術組比較，CPR組大鼠復蘇后血清TNF—α、IL—6均明顯升高，Hemin誘導HO-1表達增高后，明顯抑制炎癥因子的釋放。Hemin組復蘇后24h TN

9、F—α水平已接近假手術組，IL—6水平復蘇后未見明顯升高。ZnPP抑制HO-1表達后，Hemin+ZnPP組復蘇后TNF—α、IL—6水平亦明顯升高，與CPR組水平無顯著性差異。 6、大鼠復蘇后心肌氧化應激指標變化 與假手術組比較，CPR組復蘇后6h、24h心肌組織勻漿MDA均升高，SOD降低，心肌組織硝基硌氨酸蛋白表達明顯增多。Hemin組誘導HO-1表達后，心肌MDA降低，SOD升高，明顯抑制心肌硝基硌氨酸蛋白表達。

10、ZnPP抑制HO-1表達后，Hemin的保護作用消失。 結論： 1、心肺復蘇中全心缺血再灌注損傷誘導心肌組織HO-1的表達上調。 2、Hemin誘導心肌HO-1過表達，可減輕心肌損傷，保存心肌超微結構完整，改善復蘇后心功能。 3、HO-1過表達可抑制復蘇后炎癥因子的釋放，改善心肌氧化應激狀態(tài)，可能是HO-1對復蘇后心肌損傷發(fā)揮保護作用的機制。 第二部分血紅素氧合酶-1對缺氧再復氧損傷心肌細胞的保護

11、作用研究 研究目的： 在體外原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，建立心肌細胞缺氧再復氧損傷模型，在體外試驗中模擬心肺復蘇過程中的心肌缺血再灌注損傷過程。在細胞水平證實誘導HO-1過表達，對缺氧再復氧損傷心肌細胞是否有保護效應，并初步探討其機制。 材料和方法： 酶消化法原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，采用無糖、無血清、0.5％O2培養(yǎng)2h，恢復糖、血清及氧供應6h建立心肌細胞缺氧再復氧損傷模型。應用Hemin和ZnPP缺氧前24h

12、預處理心肌細胞，設正常對照組(C組)、缺氧再復氧組(HR組)、Hemin組及Hemin+ZnPP組。采用采用蛋白免疫印跡和免疫組化方法檢測心肌細胞HO-1蛋白表達；觀察細胞再復氧后上清LDH水平，胎盤蘭染色觀察心肌細胞活力；觀察心肌細胞形態(tài)及超微結構變化。測定細胞上清MDA和SOD水平，以及TNF—α、IL—6水平。免疫組化方法檢測心肌細胞再復氧6h硝基硌氨酸蛋白表達。 結果： 1、心肌細胞原代培養(yǎng) 采用酶消化法

13、原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，經α—橫紋肌肌動蛋白細胞免疫化學鑒定心肌細胞純度為90.5±1.4％，培養(yǎng)至第4天心肌細胞搏動頻率180次/min左右。 2、心肌細胞缺氧再復氧損傷模型建立 心肌細胞培養(yǎng)至第5天，0.5％O2、無糖、無血清培養(yǎng)2h，恢復糖、血清及氧供應正常培養(yǎng)6h，胎盤蘭染色示心肌細胞活力降低，搏動減慢，細胞皺縮，顆粒增多，電鏡下見線粒體腫脹，嵴斷裂，肌絲模糊。缺氧再復氧處理導致心肌細胞功能、結構明顯損傷。

14、 3、心肌細胞缺氧復氧后HO-1表達 蛋白免疫印跡和免疫組化方法證實心肌細胞缺氧再復氧后HO-1表達增高，Hemin處理進一步升高HO-1表達，ZnPP抑制HO-1表達。 4、缺氧復氧后心肌細胞活力變化 HR組缺氧再復氧后LDH釋放增多，胎盤蘭染色細胞存活率明顯下降，Hemin預處理誘導HO-1過表達，降低缺氧再復氧心肌細胞LDH釋放，提高細胞存活率。ZnPP抑制HO-1表達，阻斷Hemin的保護作用。

15、 5、心肌細胞缺氧復氧后病理形態(tài)變化 HR組缺氧再復氧后，細胞損傷重，線粒體腫脹、空泡變性，嵴溶解消失，肌漿網擴張，心肌細胞肌絲排列紊亂。Hemin處理誘導HO-1過表達，明顯保持心肌細胞缺氧再復氧后形態(tài)學和超微結構的完整性，ZnPP可阻斷其保護效應。 6、心肌細胞缺氧復氧后炎癥因子水平 HR組細胞缺氧復氧后細胞上清TNF—α、IL—6水平升高，Hemin處理誘導HO-1過表達降低細胞缺氧復氧后TNF—α、I

16、L—6的釋放。 7、心肌細胞缺氧復氧后氧化應激指標 HR組細胞缺氧復氧后細胞上清MDA水平增高，SOD降低，免疫細胞化學示硝基硌氨酸蛋白表達增高。Hemin誘導HO-1過表達可降低MDA，升高SOD，降低硝基硌氨酸蛋白表達。ZnPP抑制HO-1表達后，可阻斷Hemin的保護作用。 結論： 1、成功建立較好模擬體內缺血再灌注損傷的體外心肌細胞缺氧再復氧損傷模型。 2、心肌細胞缺氧再復氧誘導HO-1