血紅素氧合酶-1對缺氧引起腸黏膜損傷保護(hù)作用的實驗研究.pdf

1、目的:
　　腸道不僅是營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的重要場所，而且還具有內(nèi)分泌功能、免疫調(diào)節(jié)和黏膜屏障功能。其中腸黏膜屏障是維持腸道正常功能的基礎(chǔ)，在嚴(yán)重創(chuàng)傷、急性胰腺炎、大面積燒、腹部手術(shù)、出血性休克、彌漫性腹膜炎、腸梗阻等應(yīng)激狀態(tài)下，腸黏膜的結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，導(dǎo)致腸黏膜屏障功能遭到破壞，通透性增強(qiáng)，進(jìn)而引起細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位，造成腸源性感染，引起全身器官功能的損害。腸道不僅是多器官功能障礙綜合癥(multiple organs dys

2、function syndrome，MODS)的靶器官，而且還被認(rèn)為是MODS的“動力部位”。血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase，HO-1)是一種誘導(dǎo)型酶，在休克、缺氧、感染、缺血-再灌注、重金屬離子等應(yīng)激狀態(tài)的刺激下可誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。HO-1是催化血紅素分解代謝的限速酶，分解血紅素產(chǎn)生一氧化碳(carbon monoxide，CO)、膽綠素(biliverdin)和游離鐵離子(Fe2+)。研究證實，HO-1及其代謝產(chǎn)物參與

3、機(jī)體的許多生理和病理過程，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡和細(xì)胞保護(hù)作用。因此，我們推測:HO-1對腸黏膜屏障同樣具有保護(hù)作用。本研究通過建立體外腸上皮黏膜屏障模型，通過觀察緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的分布和表達(dá)的變化對腸黏膜屏障功能的影響，旨在證實HO-1對腸上皮細(xì)胞緊密連接的保護(hù)作用，并進(jìn)一步闡述HO-1的部分作用機(jī)制，為臨床上治療腸道疾病提供理論依據(jù)和新的治療策略。
　　方法:
　　建立人Caco-2細(xì)胞體外腸上皮

4、細(xì)胞屏障模型，建立細(xì)胞缺氧模型和HO-1基因干預(yù)模型。細(xì)胞缺氧模型中，細(xì)胞分為四組，常氧組，分別缺氧4h、8h、12h組。構(gòu)建人血紅素氧合酶-1基因真核過表達(dá)載體即pShuttle-CMV-HO-1，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞。HO-1基因干預(yù)模型細(xì)胞分為四組，①常氧組（常規(guī)培養(yǎng)）;②缺氧組（1％的O2培養(yǎng)8h）;③轉(zhuǎn)染組(pShuttle-CMV-HO-1+1％的O2培養(yǎng)8h);④質(zhì)粒對照組（pShuttle-CMV+1％的O2培養(yǎng)

5、8h）。采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋白免疫印跡(Western blot)方法檢測各組腸上皮細(xì)胞Occludin、ZO-1、HO-1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平變化。免疫熒光法觀察Occludin、ZO-1分子在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較。
　　結(jié)果:
　　(1)免疫熒光結(jié)果:常氧組Occludin、ZO-1蛋白沿細(xì)胞膜分布，緊密排列呈線性熒光，

6、邊緣光滑，細(xì)胞之間聯(lián)系緊密;缺氧組、質(zhì)粒對照組邊緣粗糙，甚至崩解斷裂，細(xì)胞間出現(xiàn)間隙;HO-1基因轉(zhuǎn)染組破壞減輕，邊緣呈連續(xù)性。
　　(2) RT-PCR、Western Blot的檢測結(jié)果顯示:缺氧可引起緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，隨著缺氧時間的延長，緊密連接蛋白的表達(dá)水平逐漸下降;HO-1基因轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞后，可以促進(jìn)緊密連接蛋白Occludin、ZO-1的mRNA和蛋白表達(dá)。