胡黃連苷Ⅱ?qū)毙阅摱拘愿螕p傷小鼠的保護(hù)及機(jī)制研究.pdf

1、研究目的
　　膿毒癥所致的多臟器功能衰竭(MOF)，在危重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域仍是危害人類健康的重大難題，而膿毒性肝損傷目前在臨床上病死率一直居高不下。因此亟待探索其發(fā)病機(jī)制和有效的治療藥物以改善預(yù)后。胡黃連苷Ⅱ(PicrosideⅡ，PicⅡ)的抗炎、抗細(xì)胞凋亡等藥理作用目前已得到公認(rèn)，而對(duì)膿毒性肝損傷研究甚少。本課題擬通過腹腔注射脂多糖/D-氨基半乳糖苷(LPS/D-GalN)構(gòu)建經(jīng)典的急性肝損傷(ALI)動(dòng)物模型，采用熒光定量PCR、

2、流式細(xì)胞術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，觀察胡黃連苷Ⅱ?qū)毙阅摱拘愿螕p傷的保護(hù)作用;體外實(shí)驗(yàn)探討胡黃連苷Ⅱ抗細(xì)胞凋亡、焦亡的作用機(jī)制。
　　研究方法
　　1.胡黃連苷Ⅱ?qū)PS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性膿毒性肝損傷的影響
　　(1)C57BL/6雄性小鼠40只，隨機(jī)分為生理鹽水(NS)組，ALI組、ALI+ PicⅡ組、PicⅡ組，每組10只。ALI+ PicⅡ組及PicⅡ組分別于LPS/D-GalN注射前24h，1

3、2h，6h，1h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)腹腔注射20mg/kg胡黃連苷Ⅱ，NS組和ALI組同時(shí)間同劑量腹腔注射NS;接下來ALI+ PicⅡ組與ALI組腹腔注射LPS10μg/只和D-GalN800mg/kg，NS組和PicⅡ組腹腔注射等劑量的NS，觀察造模后16h內(nèi)小鼠生存率。
　　(2) C57BL/6雄性小鼠12只，分為上述4組，每組3只。處理同上，于造模后5h眼球靜脈采血，頸脫臼處死小鼠。分別檢測(cè)血清炎癥因子TNF-α、IL-6，ALT

4、、AST水平;觀察各組小鼠肝組織大體形態(tài)，肝HE染色，檢測(cè)肝組織TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)水平，綜合評(píng)價(jià)各組肝功能狀態(tài)。提取各組剩余肝組織的肝細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)AnnexinⅤ-PE，caspase-1-FITC，7AAD的熒光強(qiáng)度變化;羅丹明123檢測(cè)線粒體膜電位變化;Western Blot檢測(cè)caspase-3活化水平，pro-caspase-1，caspase-1(p20)蛋白的表達(dá)。
　　2.胡黃連苷Ⅱ

5、抗凋亡、焦亡的作用機(jī)制
　　(1)提取C57BL/6雄性小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，分為對(duì)照組（A組），胡黃連苷Ⅱ組(B組)，LPS組（C組），LPS+胡黃連苷Ⅱ組（D組）。Western Blot檢測(cè)pJNK、Bcl-2/Bax表達(dá)，探索PicⅡ抗細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。
　　(2)提取C57BL/6雄性小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，分為對(duì)照組（E組），胡黃連苷Ⅱ組口組），LPS+ATP組（G組），LPS+ATP+胡黃連苷Ⅱ組（H組）。ELISA檢

6、測(cè)上清IL-1β、IL-18水平;Western Blot檢測(cè)pro-caspase-1，caspase-1(p20)，NLRP3、ASC變化，探索PicⅡ抗細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制。
　　研究結(jié)果
　　1.與NS組相比，ALI組小鼠16h生存率明顯下降，ALI+ PicⅡ組較ALI組升高。血清TNF-α、IL-6，ALT、AST含量，肝組織TNF-α、IL-6 mRNA在ALI組表達(dá)顯著升高(P＜0.05); ALI+ PicⅡ

7、組上述各指標(biāo)比ALI組下降(P＜0.05)，ALI+ PicⅡ組比PicⅡ組高(P＜0.05）。
　　2.肝臟外觀:ALI組肝臟腫大，被膜緊張，明顯淤血和出血，而ALI+ PicⅡ組僅為輕度淤血。肝臟病理切片經(jīng)HE染色顯示ALI組肝細(xì)胞壞死，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和充血，ALI+ PicⅡ組則表現(xiàn)為輕度的病理改變。肝細(xì)胞經(jīng)AnnexinⅤ/7AAD染色后，ALI組肝細(xì)胞凋亡率明顯高于NS組(P＜0.05)，ALI+ PicⅡ組較ALI組

8、凋亡率下降（P＜0.05）。羅丹明123染色顯示ALI組陽(yáng)性率明顯高于NS組(P＜0.05)，ALI+ PicⅡ組陽(yáng)性率低于PicⅡ組（P＜0.05）。經(jīng)caspase-1/7AAD染色結(jié)果顯示:ALI組肝細(xì)胞的焦亡率明顯高于NS組(P＜0.05)，ALI+PicⅡ組較ALI組下降，但高于PicⅡ組(P＜0.05)。四組pro-caspase-3表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05），ALI組活化的caspase-3明顯高于NS組(P＜0

9、.05），ALI+ PicⅡ組高于PicⅡ組（P＜0.05）;各組pro-caspase-1表達(dá)含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。ALI組活化的caspase-1表達(dá)明顯高于NS組(P＜0.05)，ALI+ PicⅡ組高于PicⅡ組(P＜0.05)。
　　3.體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn):細(xì)胞凋亡模型經(jīng)胡黃連苷Ⅱ干預(yù)后顯示:B組p-JNK明顯高于A組，C組比B組下降，C組比D組表達(dá)增高(P＜0.05）;B組Bcl-2/Bax明顯低于A組，C組比B

10、組升高，C組比D組表達(dá)增高(p＜0.05);細(xì)胞焦亡模型經(jīng)胡黃連苷Ⅱ干預(yù)后顯示:F組細(xì)胞上清IL-1β、IL-18濃度明顯高于E組(P＜0.05），G組低于F組(P＜0.05)。Western Blot檢測(cè)NLRP3，ASC，caspase-1(p20)變化:F組明顯高于E組(P＜0.05），G組比F組下降(P＜0.05)，G組比H組高(P＜0.05)。
　　結(jié)論
　　1.胡黃連苷Ⅱ抑制LPS/D-GalN誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的