FOXO1及牙周病致病菌影響口腔黏膜愈合機(jī)制.pdf

1、口腔黏膜由復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞覆蓋，該層細(xì)胞形成了抵御病原微生物入侵的重要防線。受黏膜上皮細(xì)胞遷移及增殖活性影響，黏膜上皮的再上皮化進(jìn)程很大程度上決定了黏膜傷口的愈合速度。以往研究顯示，糖尿病導(dǎo)致的高糖環(huán)境嚴(yán)重降低了皮膚上皮角化細(xì)胞的遷移和增殖能力，進(jìn)而減緩了皮膚傷口的愈合速度。而作為叉頭轉(zhuǎn)錄因子亞家族成員的FOXO1轉(zhuǎn)錄因子被證實(shí)能夠參與細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激和糖代謝的調(diào)節(jié)，相比于血糖正常動(dòng)物的皮膚傷口區(qū)域，糖尿病動(dòng)物皮膚傷口區(qū)域FOXO1

2、活性顯著提高。然而，目前有關(guān)糖尿病影響口腔黏膜傷口愈合的相關(guān)研究極少。本文分析了血糖正常及糖尿病情況下的口腔黏膜傷口愈合過(guò)程，并研究了FOXO1對(duì)口腔黏膜傷口愈合的影響，此外，還考察了口腔內(nèi)牙周病致病菌作為潛在的局部影響因素，對(duì)口腔黏膜傷口愈合的影響。
　　(1) FOXO1影響口腔黏膜傷口愈合細(xì)胞機(jī)制:本文首先利用Cre/loxP系統(tǒng)敲除了小鼠上皮細(xì)胞中的FOXO1基因，并通過(guò)鏈尿霉素腹腔注射以使小鼠形成I型糖尿病。隨后，通過(guò)穿

3、孔器使小鼠舌背表面形成1.5 mm直徑的黏膜傷口，以比較不同小鼠的傷口愈合情況。研究結(jié)果顯示，與血糖正常動(dòng)物相比，糖尿病動(dòng)物受高糖環(huán)境的影響，其黏膜上皮細(xì)胞的遷移和增殖活性分別下降了83％和54％，導(dǎo)致糖尿病動(dòng)物黏膜傷口愈合速度顯著降低，體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞遷移和增殖活性的抑制作用。為分析細(xì)胞遷移和增殖活性的改變機(jī)制，本文考察了上皮細(xì)胞中特異性敲除FOXO1基因的小鼠，在血糖正常與糖尿病情況下的愈合情況。研究發(fā)現(xiàn)，受糖尿病的影

4、響，F(xiàn)OXO1在傷口區(qū)黏膜上皮細(xì)胞中的活化水平較血糖正常動(dòng)物高2.6倍，而FOXO1基因敲除后，受糖尿病影響而降低的細(xì)胞遷移和增殖活性均顯著恢復(fù)，但是，在血糖正常動(dòng)物中，基因敲除通過(guò)降低細(xì)胞遷移活性進(jìn)而減緩了傷口愈合。
　　(2) FOXO1下游靶基因的篩選及鑒定:為考察FOXO1影響口腔黏膜傷口愈合的分子機(jī)制，通過(guò)基因芯片及Real-time PCR技術(shù)，篩選出受FOXO1調(diào)控及高糖環(huán)境影響的下游基因CCL20和IL1F9。結(jié)果

5、顯示，受高糖環(huán)境的刺激，體外培養(yǎng)的人口腔黏膜上皮細(xì)胞中CCL20和IL1F9的mRNA分別提高了64％和33％，而受FOXO1基因敲除的影響，CCL20和IL1F9的mRNA水平顯著降低。與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，在糖尿病動(dòng)物的口腔黏膜傷口新生上皮中，CCL20和IL1F9蛋白表達(dá)水平較血糖正常動(dòng)物顯著提高，而在FOXO1基因敲除后，二者蛋白表達(dá)水平顯著降低。
　　(3) CCL20與IL1F9對(duì)口腔黏膜上皮細(xì)胞遷移的影響:本文利用中和

6、抗體，降低了高糖環(huán)境中口腔黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)量CCL20及IL1F9，以考察其對(duì)細(xì)胞遷移活性的直接影響。過(guò)量的CCL20或IL1F9被中和后，細(xì)胞在高糖環(huán)境中的遷移水平分別提高60％及110％。當(dāng)CCL20與IL1F9被同時(shí)中和后，細(xì)胞遷移活性的提升表現(xiàn)出疊加的效果。同時(shí)，在標(biāo)準(zhǔn)低糖濃度環(huán)境中，添加重組的CCL20或IL1F9導(dǎo)致細(xì)胞的遷移活性降低。上述研究結(jié)果均表明，過(guò)量的CCL20與IL1F9抑制了細(xì)胞遷移，進(jìn)而解釋了高糖環(huán)境通過(guò)

7、刺激FOXO1活化而提高其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響?zhàn)つど掀ぜ?xì)胞的遷移，并最終影響口腔黏膜傷口愈合的分子機(jī)制。
　　(4)牙周病致病菌對(duì)口腔黏膜傷口愈合的影響及IgY抑菌效果:通過(guò)考察口腔內(nèi)牙周病主要致病菌——具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌，對(duì)口腔黏膜傷口愈合的影響發(fā)現(xiàn)，兩種病原菌通過(guò)刺激黏膜上皮細(xì)胞的凋亡，從而降低了黏膜上皮細(xì)胞的再上皮化速度。為探索抑制口腔內(nèi)病原微生物安全有效的方法，將兩種病原菌免疫蛋雞并分離純化得到卵黃抗體(Ig

8、Y)，體外實(shí)驗(yàn)表明，抗具核梭桿菌和抗牙齦卟啉單胞菌特異性IgY均能有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，免疫熒光和免疫電鏡實(shí)驗(yàn)觀察到IgY可與兩種病原菌高效結(jié)合，初步探討了IgY抑制牙周病致病菌生長(zhǎng)的作用機(jī)制。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，IgY能夠抑制牙周病致病菌在口腔內(nèi)定植引起的牙周病的發(fā)展。由于對(duì)牙周病致病菌的抑制，IgY可能會(huì)加速由致病菌減緩的口腔黏膜傷口愈合。
　　綜上所述，受糖尿病影響，口腔黏膜傷口愈合速度顯著降低。高糖環(huán)境刺激FOXO1轉(zhuǎn)錄因子的活化

9、，而提高其下游靶基因CCL20和IL1F9的表達(dá)，利用中和抗體降低口腔黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)量CCL20和IL1F9，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的遷移水平顯著提高，闡明了高糖環(huán)境中過(guò)度活化的FOXO1抑制口腔黏膜傷口愈合機(jī)制。在正常糖濃度下，F(xiàn)OXO1的敲除通過(guò)降低細(xì)胞的遷移水平而減緩口腔黏膜傷口愈合速度，證實(shí)了FOXO1在正常糖濃度環(huán)境中對(duì)傷口愈合的必要性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，口腔內(nèi)的具核梭桿菌和牙齦卟啉單胞菌，通過(guò)刺激口腔黏膜上皮細(xì)胞的凋亡，從而降低口腔