多重PCR檢測(cè)食源性致病菌的研究.pdf

1、民以食為天,食以安為先。近年來,食品安全突發(fā)事件頻率高是食品安全問題的一個(gè)顯著特點(diǎn)。其中食品中污染致病菌是引發(fā)食源性疾病的主要因素,加強(qiáng)食品檢驗(yàn)力度是解決食品安全問題的最有效的途徑。國內(nèi)檢測(cè)食品中致病菌主要采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和PCR方法,傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法操作繁瑣,一般需4d～7d。PCR檢測(cè)方法針對(duì)某一種或一類病原菌,但是一旦檢測(cè)的方向有誤就會(huì)造成時(shí)間和藥品浪費(fèi)。多重PCR彌補(bǔ)了普通PCR的缺點(diǎn),該方法作為一種可同時(shí)檢測(cè)多種致病菌的方法發(fā)

2、展十分迅速。
　　 本研究建立了單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌及腸出血性大腸桿菌O157:H7的多重PCR快速檢測(cè)技術(shù)。首先根據(jù)單增李斯特氏菌溶血素基因(hlyA)、金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因(nuc)和腸出血性大腸桿菌O157抗原特異基因(rfbE)基因序列,利用Primer5.0設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行多重PCR反應(yīng)。將其反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5％瓊脂糖凝膠電泳,應(yīng)用瓊脂糖凝膠系統(tǒng)觀察結(jié)果。并將多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序,登陸Gen

3、ebank將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)上blast同源性對(duì)比,從而證實(shí)三對(duì)引物的特異性。本研究選取大量陽性菌株和非陽性干擾菌株進(jìn)行性特異性驗(yàn)證,結(jié)果設(shè)計(jì)的單增李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌及腸出血性大腸桿菌引物均能擴(kuò)增出439bp、230bp、151bp的目的片段,其他菌株均為陰性。還進(jìn)一步將三種菌株DNA進(jìn)行隨機(jī)組合進(jìn)行多重PCR反應(yīng)檢測(cè)其反應(yīng)的特異性,結(jié)果顯示均能擴(kuò)增出特異性目的片段。由此可知,多重PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng),可用于同時(shí)檢測(cè)三種致病菌的

4、一種或幾種。
　　 本研究對(duì)多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化,試驗(yàn)過程中對(duì)鎂離子和引物的添加量、dNTPs的添加量、Taq酶的添加量、退火溫度和退火時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。最終確定了多重PCR反應(yīng)的最佳反應(yīng)體系和最佳反應(yīng)條件,該反應(yīng)體系為:總反應(yīng)體系50μL。包括5μL10×PCRbuffer,3.5μLMg2+(25mM),5.5μLdNTPs,0.6μL(5U/μL)Taq酶,單增李斯特氏菌10μmol/L上下游引物量均為2μL、金黃色葡

5、萄球菌10μmol/L上下游引物量均為2.2μL、腸出血性大腸10μmol/L上下游引物量均為1.8μL,模板各2μL,滅菌水補(bǔ)足至50μL。最佳反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min-55.4℃45s-72℃1min進(jìn)行33個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5min。
　　 本研究對(duì)三種食源性致病菌純菌培養(yǎng)物單菌檢測(cè)靈敏度均為101CFU/mL;同時(shí)檢測(cè)三種食源性致病菌的靈敏度均為102CFU/mL。該研究還對(duì)人工污染的乳品

6、、肉及肉制品中三種致病菌進(jìn)行檢測(cè),確定其檢出限均為103CFU/mL。
　　 對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè),將多重PCR方法與國標(biāo)進(jìn)行比較,確定多重PCR方法對(duì)三種致病菌(單增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、腸出血性大腸桿菌)的敏感性均為100%、特異性分別為:95.6%、92.3%、92.8%;符合率分別為96.7%、93.3%、96.7%。并且在6h內(nèi)可完成檢測(cè)。結(jié)果表明本研究建立的多重PCR檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高具有很好