模擬高原低氧環(huán)境對(duì)兔牙周炎致病菌影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的及意義：
　　 高原地區(qū)自然環(huán)境惡劣，大氣壓低、氧分壓低、寒冷、風(fēng)大、輻射強(qiáng)等，嚴(yán)重影響人們的口腔和全身健康。國(guó)內(nèi)大量研究[1-2]顯示高原地區(qū)牙周病的發(fā)病率及病程進(jìn)展速度遠(yuǎn)高于平原地區(qū)。但目前的研究多停留在流行病學(xué)調(diào)查層面，僅對(duì)此臨床現(xiàn)象有一定認(rèn)識(shí)，對(duì)其發(fā)生、發(fā)展的病理生理特點(diǎn)及發(fā)病機(jī)制仍缺乏足夠的研究和認(rèn)識(shí)，影響臨床防治效果。
　　 菌斑細(xì)菌是牙周病的始動(dòng)因子。牙周致病菌以厭氧菌為主，其發(fā)生發(fā)展與宿主防御機(jī)制、細(xì)

2、菌之間相互作用、細(xì)菌在牙周定植的數(shù)量水平等諸多因素有關(guān)[3]。由于牙周局部生態(tài)環(huán)境和牙周微生物生態(tài)關(guān)系的復(fù)雜性，以及技術(shù)上的障礙，很多問(wèn)題仍然沒(méi)有完全闡明。本課題組在前期研究中，通過(guò)PCR-變形梯度凝膠電泳技術(shù)(polymerase chainreaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)發(fā)現(xiàn)，模擬高原低氧環(huán)境下SD大鼠牙周炎致病菌具有多樣性，且與平原牙周炎致病菌種類

3、存在顯著差異。由此我們推測(cè)，高原低壓、低氧的特殊環(huán)境會(huì)影響口腔微生物，尤其是牙周厭氧菌在齦袋的選擇性定植，其數(shù)量及內(nèi)毒素水平存在差異。
　　 本實(shí)驗(yàn)?zāi)M高原低氧環(huán)境建立兔牙周炎動(dòng)物模型后，采用厭氧菌的分離、培養(yǎng)、鑒定及內(nèi)毒素檢測(cè)等技術(shù)對(duì)不同條件下兔齦下菌斑中定植的細(xì)菌種類、數(shù)量及內(nèi)毒素水平，以及兔齦溝液pH值、活菌數(shù)、內(nèi)毒素水平與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性作初步探討，并對(duì)牙周主要致病厭氧菌，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas

4、gingivalis，Pg)在不同條件下兔齦下菌斑中的檢出率及內(nèi)毒素水平作相關(guān)研究，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)假設(shè)，進(jìn)一步豐富高原牙周病微生物學(xué)的基礎(chǔ)研究。
　　 方法及步驟：
　　 1、40只雄性大白兔隨機(jī)分為4組(平原對(duì)照組、平原實(shí)驗(yàn)組、高原對(duì)照組及高原實(shí)驗(yàn)組)，每組10只，實(shí)驗(yàn)組聯(lián)合正畸絲結(jié)扎兔雙下頜中切牙及牙周炎食譜飼養(yǎng)的方法建立牙周炎模型，高原組送入低壓氧艙內(nèi)飼養(yǎng)(模擬海拔高度5000m，23h/d)，平原組在平原環(huán)境下飼養(yǎng)(重

5、慶，平均海拔400m)。
　　 2、建模8周后檢測(cè)各組兔附著喪失(attachment loss，AL)，并記錄菌斑指數(shù)(plaqueindex，PLI)和牙齦指數(shù)(gingival index，GI)；pH試紙檢測(cè)兔齦溝液pH值；拍攝兔下頜前牙X線片觀察牙槽骨吸收情況；切取牙周組織標(biāo)本，采用HE染色觀察組織病理改變。
　　 3、采集兔雙下頜中切牙牙周袋內(nèi)齦下菌斑，進(jìn)行厭氧菌的分離、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、鏡檢、內(nèi)毒素檢測(cè)，分析牙周

6、臨床指標(biāo)與兔齦溝液pH值、活菌數(shù)及內(nèi)毒素水平的相關(guān)性。
　　 4、從成功培養(yǎng)出的牙周厭氧菌中分離、培養(yǎng)、鑒定Pg，并比較各組Pg的檢出率及內(nèi)毒素水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 一、動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、組織病理學(xué)觀察：平原對(duì)照組及高原對(duì)照組齦溝內(nèi)上皮無(wú)病理性改變，牙周膜纖維排列整齊，細(xì)胞排列有序，牙槽嵴無(wú)吸收，牙槽骨無(wú)破壞；平原實(shí)驗(yàn)組齦溝內(nèi)上皮出現(xiàn)糜爛，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，牙周膜間隙增寬，牙槽骨少

7、量破壞；高原實(shí)驗(yàn)組齦溝內(nèi)上皮出現(xiàn)糜爛，可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等浸潤(rùn)，牙周膜間隙增寬，牙周膜纖維排列紊亂或斷裂，可見(jiàn)牙槽嵴水平降低。
　　 2、X線片觀察：平原對(duì)照組及高原對(duì)照組牙周膜間隙未見(jiàn)明顯異常，牙槽嵴頂未見(jiàn)明顯吸收；平原實(shí)驗(yàn)組及高原實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)牙周膜間隙增寬，牙槽嵴頂吸收，呈不規(guī)則降低，其中以高原實(shí)驗(yàn)組更為嚴(yán)重。
　　 3、各項(xiàng)牙周臨床指標(biāo)檢測(cè)：高原實(shí)驗(yàn)組AL、PLI、GI均高于其余各組，且與平原實(shí)驗(yàn)

8、組比較有顯著差異(P<0.01)。
　　 二、厭氧菌分離、培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、兔牙周厭氧菌經(jīng)革蘭氏染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，平原組齦下菌斑中細(xì)菌種類單一，主要以G-桿菌及球菌為主，而高原組細(xì)菌種類則較為豐富，G-桿菌、球菌，G+桿菌、球菌均占一定比例。
　　 2、高原實(shí)驗(yàn)組兔齦溝液pH值、活菌數(shù)及內(nèi)毒素水平均高于其余各組，且與平原實(shí)驗(yàn)組比較有顯著差異(P<0.05)。
　　 3、齦溝液pH值

9、、活菌數(shù)與AL、PLI、GI有一定的相關(guān)性，呈正相關(guān)(P<0.01)；內(nèi)毒素水平與AL呈正相關(guān)(P<0.01)，與PLI、GI無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。
　　 三、Pg分離、培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、Pg在CDC血平板上純化培養(yǎng)5d后，可形成直徑約1-2mm菌落，棕色或黑色，呈凸起狀，表面光滑，似金屬光澤，邊緣整齊，完全溶血；革蘭氏染色后光學(xué)顯微鏡下觀察，Pg為G-桿菌或球桿菌，染色不均。
　　 2、除平原對(duì)照

10、組外，其余三組均成功檢出Pg；與平原實(shí)驗(yàn)組比較，高原實(shí)驗(yàn)組中Pg的檢出率及內(nèi)毒素水平均有顯著差異(P<0.05)。
　　 研究結(jié)論：
　　 1、本研究成功建立了兔高原及平原牙周炎模型，各項(xiàng)結(jié)果顯示高原實(shí)驗(yàn)組與平原實(shí)驗(yàn)組在臨床表現(xiàn)、牙周臨床指標(biāo)及牙周菌群等方面均存在顯著差異，證實(shí)高原低壓低氧的特殊環(huán)境加快了牙周炎的進(jìn)展速度，加重了炎癥的破壞程度。
　　 2、高原低壓低氧的特殊環(huán)境更有利于G-厭氧菌的定居，使得牙周袋