Fas-FasL途徑在海水誘導肺泡上皮細胞凋亡中的調(diào)控作用.pdf

1、研究背景
　　淹溺是人類意外死亡的重要原因，是全球性的公共衛(wèi)生課題之一。在海上工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、軍事行動和日常生活中，海水淹溺事件時有發(fā)生。海水進入呼吸道可直接導致溺水者窒息死亡，海水充塞肺泡后引起海水淹溺性肺水腫（pulmonaryedemaofseawaterdrowning，PE-SWD），導致海水淹溺型急性肺損傷（seawaterdrowning-inducedacutelunginjury，SW-ALI），繼而惡化為海水淹溺型

2、呼吸窘迫綜合征（seawaterdrowning-inducedrespiratorydistresssyndrome，SW-RDS）。
　　SW-ALI發(fā)生時，進入肺內(nèi)的海水直接損傷肺泡上皮細胞（alveolarepithelialcell，AEC），并由此導致低氧血癥和酸中毒。因此，AEC對SW-ALI的發(fā)生、發(fā)展及預后至關(guān)重要。同時既往研究表明，F(xiàn)as/FasL途徑是急性肺損傷（acutelunginjury，ALI）時AE

3、C凋亡的重要機制之一。我們前期實驗已證實，SW-ALI存在肺組織細胞凋亡。但海水是否通過Fas/FasL途徑誘導AEC凋亡尚不清楚。
　　目的
　　通過建立SW-ALI動物模型和使用海水干預人肺泡上皮A549細胞，觀察海水對AEC凋亡的影響，闡明Fas/FasL途徑在海水誘導AEC凋亡中的作用。
　　方法
　　1、動物實驗：48只SD雄性大鼠隨機分為四組：（1）正常對照組；（2）1h海水組；（3）2h海水組；（4

4、）4h海水組。麻醉后，除正常對照組外，其余各組大鼠通過氣管在4min內(nèi)勻速滴入4ml/kg海水。于各時間點將動物處死后取肺組織，分別檢測肺濕/干比（W/D）、肺泡灌洗液（BALF）蛋白濃度、伊文斯藍漏出指數(shù)（ELI）；行肺組織病理染色（HE）和海水灌注4h后Fas和FasL蛋白免疫組化染色；Westernblotting檢測Fas、FasL、cleavedcaspase-8、cleavedcaspase-3蛋白。
　　2、細胞實驗

5、：10％、20％、40％和60％海水（海水與培養(yǎng)基體積比分別為1:9、1:4、2:3和3:2）刺激人肺泡上皮A549細胞6h；40％海水刺激A549細胞1h、2h、4h和6h，觀察相同時間不同濃度海水和同一濃度海水不同時間對細胞凋亡的誘導作用。為明確FasL和caspase-8蛋白激活與海水誘導A549凋亡之間的關(guān)系，選擇40％海水干預6h作進一步研究，在加入海水前60min，10μg/ml抗FasL中和性抗體NOK-2或20μΜcas

6、pase-8抑制劑Z-IETD-FMK預孵育細胞，流式細胞儀檢測凋亡，Westernblotting檢測各組Fas、FasL、cleavedcaspase-8、cleavedcaspase-3蛋白表達。
　　結(jié)果
　　1、動物實驗：海水吸入后，大鼠肺W/D、BALF蛋白濃度及ELI明顯升高，結(jié)合HE結(jié)果表明海水導致了典型的ALI。免疫組化和Westernblotting檢測結(jié)果顯示，海水同時上調(diào)Fas、FasL蛋白的表達，c

7、leavedcaspase-8、cleavedcaspase-3蛋白也相應增加。
　　2、細胞實驗：海水呈濃度和時間依賴性誘導A549細胞凋亡，同時Fas、FasL、cleavedcaspase-8和cleavedcaspase-3蛋白表達相應上調(diào)。加入NOK-2或Z-IETD-FMK可明顯減少細胞凋亡，而且NOK-2能夠降低FasL的表達和caspase-8、caspase-3蛋白活化，但對Fas沒有影響；Z-IETD-FMK不