自噬在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞死亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的：
　　肺泡上皮細(xì)胞是急性肺損傷(acute lung injury, ALI)時(shí)受損的重要靶細(xì)胞，肺泡上皮細(xì)胞死亡是急性肺損傷的顯著特征。肺泡上皮細(xì)胞損傷在ALI的發(fā)病中具有重要作用，也是評(píng)估預(yù)后的重要指標(biāo)。內(nèi)毒素是導(dǎo)致急性肺損傷的重要因素，其主要成分脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)在ALI中起重要作用，目前認(rèn)為過激的LPS-鐘形受體4(toll like receptor4，TLR4)應(yīng)答所致的

2、炎癥反應(yīng)失控是導(dǎo)致彌漫性肺泡損傷的重要原因，然而糖皮質(zhì)激素等抗炎藥物療效有限，未能有效降低其病死率，使用促炎因子腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)受體拮抗劑患者亦未獲益，因此對(duì)LPS導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制進(jìn)行深入研究，可望為ARDS的防治提供新的靶點(diǎn)和思路。
　　本研究:(1)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)或工具藥物抑制/增強(qiáng)人

3、肺泡上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞自噬，明確自噬在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞死亡過程中的作用;(2)復(fù)制LPS所致ALI小鼠模型，觀察干預(yù)自噬對(duì)肺泡上皮屏障功能的影響，從整體水平驗(yàn)證肺泡上皮自噬與ALI肺泡上皮屏障功能障礙的關(guān)系;(3)應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制A549細(xì)胞中由LPS引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激繼之活化的未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，檢測(cè)自噬活化標(biāo)志蛋白表達(dá)及細(xì)胞存活的變化，進(jìn)一步探討LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞自噬的機(jī)制;本研究將進(jìn)一步闡明白噬

4、對(duì)肺泡上皮細(xì)胞死亡的調(diào)控作用及機(jī)制，初步揭示肺泡上皮細(xì)胞自噬在LPS所致ALI發(fā)病中的作用，為ALI的臨床治療提供部分理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　(1)自噬在LPS誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞死亡中的作用
　?、貺PS刺激A549細(xì)胞模型，通過免疫印跡檢測(cè)自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白輕鏈3B(microtubule-associated protein1 light chain3 B，LC3B)、Beclin

5、-1、自噬相關(guān)基因(Autophagy related genes，Atg)5及降解底物蛋白P62的表達(dá)變化;電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變;A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)-LC3質(zhì)粒后予LPS刺激，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染EGFP-LC3融合蛋白的集聚變化;使用LPS抑制劑多粘菌素B進(jìn)一步確定增加的自噬是否有賴于LPS的特異性刺激;
　?、贑CK-8

6、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度的LPS對(duì)A549細(xì)胞的毒性作用，并取最低有毒劑量處理細(xì)胞后，觀察細(xì)胞壞死及凋亡變化;凋亡抑制劑預(yù)處理A549細(xì)胞后予最低有毒劑量LPS刺激，觀察細(xì)胞存活率，進(jìn)一步驗(yàn)證凋亡是否參與LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞死亡的作用;
　?、圩允梢种苿┗蛟鰪?qiáng)劑預(yù)處理A549細(xì)胞后予LPS刺激，觀察細(xì)胞存活率，研究自噬對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞死亡的作用;
　?、苁褂锰禺愋孕「蓴_RNA(short interfering RNA

7、，siRNA)抑制肺泡上皮細(xì)胞自噬關(guān)鍵蛋白Beclin-1或Atg5的表達(dá)后，再予LPS刺激，觀察抑制自噬對(duì)細(xì)胞存活的影響，用遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證自噬在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞死亡中的作用。
　　(2)自噬抑制劑對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺泡上皮屏障功能障礙的保護(hù)作用
　　①建立LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型，免疫印跡檢測(cè)肺組織自噬蛋白的表達(dá)變化，免疫熒光觀察肺組織自噬蛋白的表達(dá)變化及細(xì)胞定位，透射電子顯微鏡檢測(cè)肺泡上皮細(xì)胞自噬超

8、微結(jié)構(gòu);
　?、谑褂米允伤幬镆种苿┖?，觀察肺損傷評(píng)分、肺濕干重比、支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)總蛋白的變化，用工具藥從整體上驗(yàn)證干預(yù)自噬是否對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺泡上皮屏障功能障礙起保護(hù)作用;
　　(3)LPS誘導(dǎo)的人肺泡上皮細(xì)胞株A549細(xì)胞自噬性死亡的機(jī)制
　?、貺PS刺激A549細(xì)胞后，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要標(biāo)志性分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-reg

9、ulated protein，GRP)78、GRP94的表達(dá)變化;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑作用下觀察自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B-Ⅱ的變化，研究?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)自噬的影響;
　?、贚PS刺激A549細(xì)胞后，觀察未折疊蛋白反應(yīng)的三條信號(hào)通路PERK、IRE1及ATF6的關(guān)鍵蛋白表達(dá)變化;用siRNA干擾技術(shù)分別抑制相關(guān)信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，檢測(cè)自噬活化標(biāo)志蛋白表達(dá)及細(xì)胞存活變化，從細(xì)胞水平確定LPS激活肺泡細(xì)胞自噬性死亡的相關(guān)信號(hào)通路。
　　結(jié)果：

10、
　　(1)LPS處理A549細(xì)胞后，自噬蛋白LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化及Beclin-1、Atg5的表達(dá)呈時(shí)間及劑量依賴性增加，自噬降解底物蛋白P62水平則呈時(shí)間及劑量依賴性減少;LPS抑制劑多粘菌素B預(yù)處理能抑制LPS誘導(dǎo)的LC3B-Ⅱ增加;與對(duì)照組比較，LPS處理組EGFP-LC3點(diǎn)狀聚集數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;電鏡觀察LPS處理組可見自噬體;
　　(2)與0μg/ml比較，小于50μg/ml的LPS處理

11、組細(xì)胞存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，50，100，150μg/ml的LPS處理16h后，細(xì)胞存活率下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.01)，且細(xì)胞的存活率隨著LPS濃度增加而減少，表現(xiàn)為劑量依賴效應(yīng)。多粘菌素B預(yù)處理能抑制LPS所致的細(xì)胞存活率下降(P＜0.05);
　　(3)50μg/ml的LPS刺激A549細(xì)胞16小時(shí)，細(xì)胞凋亡數(shù)及乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH

12、)泄漏率（細(xì)胞壞死標(biāo)志物）與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　(4)自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)預(yù)處理能降低LPS誘導(dǎo)的LC3B-Ⅱ增加及細(xì)胞存活率的下降(P＜0.05);自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin，Rapa)預(yù)處理則增加了LPS誘導(dǎo)的LC3B-Ⅱ增加及細(xì)胞存活率的下降(P＜0.05)。與對(duì)照組比較，凋亡抑制劑預(yù)處理組細(xì)胞存活率增加差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05）

13、;
　　(5)特異性siRNA能有效抑制Beclin-1及Atg5的表達(dá)和LPS誘導(dǎo)的LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化、EGFP-LC3點(diǎn)狀聚集數(shù)的增加及細(xì)胞存活率的下降(P＜0.05);
　　(6)15 mg/kg的LPS腹腔注射小鼠16小時(shí)后，肺損傷評(píng)分，BALF中促炎因子IL-1β、TNF-α、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2(macrophage inflammatory protein-2，MIP-2)水平、細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞比例、總蛋白

14、，以及肺濕干重比較對(duì)照組增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;
　　(7)Western blot結(jié)果顯示，與生理鹽水對(duì)照組比較，LPS處理8h后小鼠肺組織中LC3B-Ⅱ的表達(dá)增加，16h后增加明顯;免疫熒光檢測(cè)顯示LPS處理16h后小鼠肺組織中LC3B的表達(dá)增加，且LC3B能夠和肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白(pulmonarysurfactant associated protein C，SPC)進(jìn)行共標(biāo)，透射電鏡結(jié)果顯示，LPS處

15、理16h后小鼠肺肺泡上皮內(nèi)有較多自噬小體，而生理鹽水對(duì)照組細(xì)胞中未觀察到自噬小體的存在;
　　(8)與對(duì)照組比較，3-MA或氯喹(chloroquine，CLQ)預(yù)處理組小鼠BALF中的總蛋白、肺濕干重比及肺損傷評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。3-MA預(yù)處理組中，BALF中的促炎因子無變化，而CLQ預(yù)處理則明顯減少了BALF中的促炎因子IL-1β,TNF-α，MIP-2水平（P＜0.01）;
　　(9)LPS

16、處理A549細(xì)胞后，GRP78、GRP94的蛋白表達(dá)呈時(shí)間及劑量依賴性增加;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate，4-PBA)能抑制LPS誘導(dǎo)的LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化;
　　(10)LPS處理A549細(xì)胞后，磷酸化的PERK(phosphorylated PERK，p-PERK)及其下游信號(hào)分子磷酸化的真核啟動(dòng)因2(phosphorylated eukaryotic initiation factor-2，p

17、-eIF2α)、ATF4、生長(zhǎng)停滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白34(growth arrest DNA damage gene34，GADD34)的表達(dá)呈時(shí)間及劑量依賴性增加，剪接型X盒結(jié)合蛋白1(splicing of X boxbinding protein1，sXBP1)，ATF6的表達(dá)無變化;
　　(11)特異性siRNA能有效抑制PERK及ATF4的表達(dá)和LPS誘導(dǎo)的LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化、EGFP-LC3點(diǎn)狀聚集數(shù)的增加及細(xì)胞存活