Fas-siRNA對Fas-FasL依賴的LPS誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響.pdf

1、目的: 通過建立LPS誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷模型，探討1、Fas-siRNA轉(zhuǎn)染肺泡Ⅱ型上皮細胞的可行性；2、Fas-siRNA對Fas/FasL依賴的LPS誘導(dǎo)肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡和炎癥反應(yīng)的影響。 方法: 經(jīng)分離純化大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞，隨機分為5組：空白組：AECⅡ（僅加脂質(zhì)體）、AECⅡ+siRNA-213組、AECⅡ+siRNA-641組、AECⅡ+siRNA-830組、AECⅡ+陰性對照

2、siRNA組。6h后觀察轉(zhuǎn)染效率，48h后RT-PCR檢測Fas mRNA表達。肺泡Ⅱ型上皮細胞分為5組：對照組、LPS組、LPS+FasL組、FasL組、LPS+FasSiRNA+ FasL組，轉(zhuǎn)染FasSiRNA后20小時，加入LPS和FasL，加入PBS為每孔容積1ml，終濃度分別為10ug/ml和5ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，RT-PCR、Westen Blot檢測Fas的表達，Westen Blot檢測p-caspase8，

3、流式檢測細胞凋亡，ELISA檢測培養(yǎng)液上清MCP-1和TNF-α的濃度。 結(jié)果: 1、siRNA轉(zhuǎn)染效率超過80％，與空白組與陰性對照組比較，AECⅡ+siRNA-213組、 AECⅡ+siRNA-641組、AECⅡ+siRNA-830組Fas-mRNA表達抑制（p<0.05），AECⅡ+siRNA-641組Fas-mRNA表達最低（p<0.05）；2、與control組比較，LPS組、LPS+ FasL組FasmRNA

4、、Fas蛋白表達增加（p<0.05），F(xiàn)asL組、LPS+FasSiRNA+FasL組Fas mRNA、Fas蛋白表達未見明顯差異（p<0.05）；與LPS組比較，LPS+FasSiRNA+ FasL組Fas mRNA、Fas蛋白表達明顯下調(diào)（p<0.05）；與control組比較，LPS組、FasL組、LPS+ FasL組、LPS+FasSiRNA+ FasL組肺泡Ⅱ型上皮細胞p-caspase表達、細胞凋亡和細胞培養(yǎng)液上清TNF-α

5、和MCP-1濃度明顯增加（p<0.05）；與LPS組比較，LPS+ FasL組肺泡Ⅱ型上皮細胞p-caspase表達、細胞凋亡和細胞培養(yǎng)液上清TNF-α和MCP-1濃度明顯增加（p<0.05）；與LPS+ FasL組比較，LPS+FasSiRNA+FasL組p-caspase表達和細胞凋亡減少，TNF-α和MCP-1濃度明顯下降（p<0.05）。 結(jié)論: Fas-siRNA成功轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的肺泡Ⅱ型上皮細胞；Fas基因沉