高氧誘導SIRT1蛋白的核漿轉位在肺泡上皮細胞凋亡中的作用.pdf

1、目的:建立高氧損傷肺泡上皮細胞模型，通過觀察細胞形態(tài)、凋亡變化，SIRT1蛋白轉位情況，SENP1蛋白及乙?；疨53蛋白表達變化，探討SIRT1蛋白在肺泡上皮細胞高氧損傷中的意義，以及SIRT1轉位抑制劑萊普霉素B對肺泡上皮細胞高氧損傷的保護作用。
　　方法:該實驗將體外傳代培養(yǎng)的人肺泡上皮細胞（HPAEpiC）作為實驗的研究對象。運用高體積分數(shù)氧誘導人肺泡上皮細胞（HPAEpiC）損傷模型為基礎，即給模型組以3L/min的速度通

2、入含900ml/LO2和50ml/LCO2高純混合氣。將傳代培養(yǎng)后的肺泡上皮細胞(HPAEpiC)隨機的分為3組，包括對照組、高氧組和高氧+萊普霉素B組。對照組:向?qū)φ战M細胞內(nèi)加入DMEM高糖培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基是含有10％胎牛血清與1％青鏈霉素，加入培養(yǎng)基后將細胞培養(yǎng)在溫度為37℃、濕度為5％的CO2培養(yǎng)箱中。高氧組:加入相同培養(yǎng)基后高氧處理細胞即以3L/min的速度往細胞內(nèi)通入含有900ml/LO2和50ml/LCO2高度純合的混合氣，

3、處理時間為10min，處理完畢后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。高氧+萊普霉素B組:加入相同的培養(yǎng)基后，加入終濃度為5ng/ml的萊普霉素B，然后以相同的速度通入相同的混合氣，同樣處理時間為10min，處理完畢后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)至12h、24h及48h后，將細胞收集好后檢測的指標是:(1)各組細胞形態(tài)學的改變使用倒置相差顯微鏡觀察并給予拍照;(2)流式細胞凋亡技術分別檢測對照組、高氧組和高氧+萊普霉素B組分組培養(yǎng)24h后的細胞

4、凋亡率;(3)采用免疫熒光檢測分組培養(yǎng)24h后對照組、高氧組和高氧+萊普霉素B組SIRT1蛋白的轉位;(4)細胞培養(yǎng)24h后采用Western Blot檢測以上三組細胞的SENP1蛋白和乙?；疨531ys(382)蛋白的表達。
　　結果:(1)倒置相差顯微鏡下可以觀察到對照組的細胞生長情況好，貼壁較好，分布均勻，大多數(shù)的細胞形態(tài)呈現(xiàn)的是長梭形或多角形，細胞與細胞間的間距小，培養(yǎng)液中觀察可見懸浮的細胞少。高氧組的細胞貼壁較差，生長情

5、況較差，大多數(shù)的細胞形態(tài)發(fā)生了改變，變成了圓形或橢圓形，培養(yǎng)液中觀察可見懸浮的細胞較多，細胞與細胞間的間距增大。與高氧組相比高氧+萊普霉素B組的細胞生長情況較好，大多數(shù)的細胞形態(tài)呈現(xiàn)的是長梭形或多角形，貼壁狀況較好，培養(yǎng)液中觀察可見懸浮的細胞減少，但較對照組稍差。(2)流式細胞凋亡結果示:高氧組細胞凋亡率顯著高于高氧+萊普霉素B組和對照組(P＜0.05);對照組凋亡率最低，三組分別比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)(3)免疫熒光結

6、果顯示:細胞核呈現(xiàn)藍色熒光，SIRT1蛋白呈現(xiàn)紅色熒光，融合熒光呈紫色。對照組細胞紅色熒光集中在細胞核，高氧組紅色熒光在細胞核及細胞質(zhì)均有分布，且較對照組，細胞質(zhì)的紅色熒光明顯，轉位細胞較對照組增多，差異有顯著性（P＜0.05），但高氧+萊普霉素B組轉位細胞率高于對照組，但低于高氧組，差異具有顯著性(P＜0.05)。(4)與對照組相比，高氧組細胞處理24h后HPAEpiC細胞內(nèi)SENP1蛋白的表達相對于對照組來說偏高，結果具有統(tǒng)計學意義

7、(P＜0.05)。處理24h后高氧組細胞內(nèi)乙?；疨53蛋白的表達高于對照組及高氧+萊普霉素B組的表達，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。高氧+萊普霉素B組乙?；疨53蛋白的表達高于對照組，但低于高氧組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論:SIRT1作為抗氧化應激的重要蛋白參與了高氧誘導的肺泡上皮細胞凋亡及肺損傷。SIRT1介導肺泡上皮細胞凋亡的機制是肺泡上皮細胞暴露于高氧后，促使SENP1蛋白表達增多，從而使SIRT