牙鲆淋巴囊腫病毒單克隆抗體的研制及應(yīng)用.pdf

1、淋巴囊腫病(Iymphocystis disease LCD)是一種世界范圍流行的魚類病毒病，病原是淋巴囊腫病毒(Iymphocystis disease virus，LCDV)?；疾◆~的主要癥狀是體表長(zhǎng)有皮膚瘤狀和菜花狀的贅生物，喪失商品價(jià)值。自1997年在威海地區(qū)養(yǎng)殖的牙鲆中首次發(fā)生以來(lái)，該病迅速蔓延至浙江、遼寧、河北等省沿海地區(qū)。近年來(lái)該病一直在養(yǎng)殖牙鲆中流行，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億元之巨。 本論文對(duì)淋巴囊腫

2、病毒純化方法、病毒結(jié)構(gòu)蛋白及其抗原性、單克隆抗體的制備、病毒培養(yǎng)及其感染牙鲆鰓細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了研究，取得了以下結(jié)果：優(yōu)化了病毒的提純方法并使之程序化；判定病毒結(jié)構(gòu)蛋白帶共有22條，且三條蛋白帶具有抗原性；制備了單克隆抗體，并應(yīng)用多種免疫學(xué)方法證實(shí)了單抗針對(duì)病毒的特異性，確認(rèn)了五個(gè)蛋白為病毒的衣殼蛋白，并且在這五個(gè)蛋白多肽上具有線形抗原決定簇；發(fā)現(xiàn)病毒感染鰓細(xì)胞后24小時(shí)之內(nèi)，開始復(fù)制，48-72小時(shí)達(dá)到頂峰。 優(yōu)化的LCDV

3、病毒提純的方法為：首先剝離囊腫組織表面的薄膜，然后采用多次勻漿處理腫瘤組織，爾后將組織勻漿液于650xg和1 800xg分別離心20 min，將離心獲得的上清液配成30[％](W／W)蔗糖溶液，4℃條件下進(jìn)行78，500×g，1 80 min超速離心，病毒沉淀用TNE緩沖液重懸后進(jìn)行蔗糖密度梯度離心即可。純化的LCDV病毒負(fù)染后，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其呈近似于圓形的多角形，結(jié)構(gòu)完整。LCDV病毒經(jīng)SDS-PAGE，硝酸銀染色，電泳圖譜清晰顯示其

4、結(jié)構(gòu)蛋白共有22條，且分子量主要集中在123-26 kDa之間。應(yīng)用兔抗LCDV血清分析結(jié)構(gòu)蛋白的抗原性，結(jié)果顯示分子量為123.55、65.292和54.438 kDa的3條蛋白帶發(fā)生了免疫反應(yīng)，其中分子量為65.292 kDa的蛋白帶反應(yīng)強(qiáng)度明顯高于其它2條蛋白帶。 以純化的LCDV為抗原免疫：Balb/C小鼠，采用單克隆抗體技術(shù)經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、有限稀釋法克隆共獲得了1 3株單克隆抗體(1A8、1D7、286、2F6、2D

5、11、2G6、3A5、3G3、3D6、3G12、4C8、4D9、486)。ELISA初步篩選結(jié)果顯示，這13株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體的吸光值相對(duì)于其他陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的較高，免疫熒光抗體技術(shù)篩選結(jié)果顯示特異性塊狀熒光信號(hào)集中在囊腫細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)邊緣部分,且多個(gè)熒光信號(hào)相連呈現(xiàn)鏈圈狀。采用Western blotting方法對(duì)單抗特異性結(jié)合的病毒蛋白多肽的分子量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示單抗1D7、286能識(shí)別一條分子量約為116 kDa蛋白多肽;單

6、抗3G3與兩條蛋白多肽反應(yīng),分子量分別為116kDa和90kDa;單抗3D6與分子量約為46kDa和65kDa的兩條多肽反應(yīng);單抗4C8能識(shí)別一條分子量約為35kDa蛋白多肽;單抗1A8、2F6、2D11、2G6、3A5、3G12、4D9、486沒有反應(yīng)條帶;應(yīng)用金標(biāo)免疫電鏡技術(shù)定位克隆的13株單抗識(shí)別的抗原決定簇,結(jié)果發(fā)現(xiàn)膠體金顆粒集中吸附在LCDV病毒粒子囊膜周圍,且背景清潔,無(wú)散在的金顆粒或其他污染物,該結(jié)果直接證明這13株單抗的

7、抗原決定簇均位于LCDV病毒核衣殼上。結(jié)合免疫電鏡和Westernblotting結(jié)果,可以斷定分子量為116 KDa、90kDa、65kDa、46kDa和35kDa的蛋白多肽為淋巴囊腫病毒衣殼蛋白,并且具有線性抗原決定簇。 另外以LCDV病毒粗提液感染牙鲆鰓細(xì)胞系,1～2天出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變現(xiàn)象(CPE)。以抗LCDV病毒單抗為第一抗體,運(yùn)用免疫熒光抗體方法、免疫細(xì)胞化學(xué)在接種病毒的鰓細(xì)胞中檢出陽(yáng)性,證實(shí)了牙鲆鰓細(xì)胞系為淋巴囊腫