O型口蹄疫病毒單克隆抗體的研制.pdf

1、單克隆抗體有著特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可開發(fā)成診斷試劑盒和試紙條及應(yīng)用于各項(xiàng)基礎(chǔ)研究。本研究旨在研制出O型口蹄疫病毒(FMDV)的單克隆抗體，進(jìn)而為研制快速、特異、靈敏和便捷的檢測FMDV抗原試劑盒和試紙條打下基礎(chǔ)。 通過細(xì)胞培養(yǎng)和病毒增殖的方法獲得含O型FMDV的培養(yǎng)液，經(jīng)過病毒滅活，濃縮，離心等步驟，提純得到了O型FMDV全病毒抗原。用該抗原對BALB/C小鼠進(jìn)行常規(guī)免疫，經(jīng)四次免疫后，應(yīng)用PEG-1000，將免疫小鼠的脾

2、細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞融合，制備雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)間接ELISA篩選和多次克隆化，獲得3個能分泌FMDV抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為細(xì)胞株2F1、6H4和2G7。 經(jīng)單克隆抗體亞類鑒定，細(xì)胞株6H4和2G7分泌的抗體為IgG1亞類，2F1分泌的抗體為IgG2b亞類。特異性檢測結(jié)果顯示，3株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株不與BHK-21正常細(xì)胞培養(yǎng)上清液發(fā)生反應(yīng)，與A型、C型和Asia1型FMDV抗原不發(fā)生型間交叉反應(yīng)。經(jīng)間

3、接ELISA測定，細(xì)胞培養(yǎng)上清液效價2F1為1:800，6H4為1:6400，2G7為1:800；腹水效價2F1為1:1×104，6H4為1:4×105，2G7為1:1×104。 單克隆抗體穩(wěn)定性檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞株6H4多次傳代后腹水效價能保持在1:8×105以上，而2F1和2G7在多次傳代后腹水效價也都能保持在1:1×104左右。純化后6H4單克隆抗體的SDS-PAGE結(jié)果顯示，Ig抗體重鏈和輕鏈，分子量分別在45.0kD和25

4、.0kD左右。對細(xì)胞株6H4的染色體計(jì)數(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞株有100條染色體。 通過ELISA試驗(yàn)對3株單克隆抗體的抗原識別位點(diǎn)進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞株6H4與2F1針對的抗原表位是部分重疊的，而與2G7針對的抗原表位是完全不一致的。 單克隆抗體結(jié)合膠體金技術(shù)初步應(yīng)用研究表明，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，可以對6H4單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記。6H4單克隆抗體在pH8.64下的穩(wěn)定點(diǎn)為12mg/L，可制備成金標(biāo)記