MicroRNA-155調(diào)控在人椎間盤退變中的作用研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　目前認為椎間盤退變?yōu)轶w內(nèi)外多種因素綜合作用的結(jié)果，凋亡的增加為其中的因素之一，而凋亡增加確切的分子機制尚不明確。研究表明，內(nèi)在性和外源性凋亡信號通路在人椎間盤髓核細胞的凋亡中均發(fā)揮作用。越來越多的證據(jù)表明凋亡機制受新近發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA，即miRNAs的調(diào)控。miRNAs廣泛參與蛋白表達的調(diào)控，在機體的多種生理和病理過程中發(fā)揮重要的作用，但是目前對其在椎間盤退變中的表達譜及發(fā)揮的作用知之甚少。本研究的目的為

2、闡述miRNAs，特別是miR-155，在椎間盤退變中的作用。
　　方法：
　　我們收集脊柱側(cè)彎(n=12)和椎間盤退變患者(n=12)的椎間盤髓核組織為對照和退變的髓核標本。我們首先從新鮮分離的人髓核細胞中分離提取總RNA，繼以miRNA芯片上進行RNA標記和雜交、分析。miRNA的相對表達量以實時定量PCR驗證。miR-155調(diào)控的靶蛋白以miRNAs網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫和計算機分析進行預(yù)測。miR-155和潛在靶蛋白的3’-UT

3、Rs的作用通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)進行分析。我們對體外培養(yǎng)的人髓核細胞轉(zhuǎn)染表達pre-miR-155的慢病毒及表達antigomiR-155的慢病毒實現(xiàn)miR-155的上調(diào)和下調(diào)。轉(zhuǎn)染成功后，以重組人FasL誘導(dǎo)凋亡后，以Western蛋白印跡檢測髓核細胞中FADD和caspase-3的表達水平，以APC-AnnexinV/7-AAD雙染流式細胞分析髓核細胞凋亡率的變化。我們以透射電鏡檢測對照組和椎間盤退變組髓核組織中的凋亡。我們以原位雜

4、交，免疫組化及雙標染色檢測miR-155，F(xiàn)ADD和caspase-3于髓核中的表達和分布。
　　結(jié)果：
　　我們發(fā)現(xiàn)人椎間盤退變髓核中29個miRNAs為差異表達，miR-155下調(diào)了0.56±0.17倍，實時定量PCR進一步證實了miR-155的下調(diào)。生物信息方法預(yù)測FADD和caspase-3為miR-155的潛在靶蛋白。miR-155可通過直接作用于其3’UTRs而抑制FADD和caspase-3的表達，而靶蛋白3’

5、UTR與miR-155結(jié)合位點的突變可組織這種抑制作用。人髓核細胞中上調(diào)miR-155的表達引起FADD和caspase-3表達的下調(diào)，而下調(diào)miR-155的表達則引起FADD和caspase-3的上調(diào)。流式細胞分析證實下調(diào)miR-155后Fas介導(dǎo)的凋亡增加，而上調(diào)miR-155后Fas介導(dǎo)的凋亡減少。同時，我們提供了椎間盤退變組織髓核細胞凋亡的透射電鏡下的直接依據(jù)。而且，miR-155表達定位于人髓核細胞胞漿中，F(xiàn)ADD和caspa

6、se-3表達于髓核細胞胞漿近胞膜處，兩者的表達為反相關(guān)，即表達miR-155的細胞為靶蛋白陰性，表達靶蛋白的細胞為miR-155陰性。另一方面，對照組及退變組髓核均主要由活細胞構(gòu)成(87.42±1.13％;83.27±5.00％,p>0.05)，細胞形態(tài)多種多樣，電鏡下可分類為典型的髓核細胞，有長突起的髓核細胞及具有吞噬功能的髓核細胞。而且，有長突起的髓核細胞存在于椎間盤退變的髓核中，吞噬功能的髓核細胞既有組織巨噬細胞溶酶體的特點，又有

7、髓核細胞多量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的特點。
　　結(jié)論：
　　本研究為目前首次對人椎間盤退變中凋亡增加的潛在分子機制及miRNAs表達譜進行的研究。同時，我們確定了caspase-3為miR-155調(diào)控的新的靶蛋白。我們的研究表明，在人椎間盤退變中，下調(diào)的miR-155通過對靶蛋白FADD和caspase-3的調(diào)控促進Fas介導(dǎo)的凋亡，提示miR-155在椎間盤退變的病因?qū)W中的作用。而且，人退變椎間盤髓核中的細胞主要為活細胞，我們提供了直接的