二甲雙胍調(diào)控髓核細(xì)胞自噬在椎間盤退變中的作用研究.pdf

1、目的：
　　椎間盤退變是導(dǎo)致下腰痛發(fā)生的重要原因，目前仍缺乏有效的藥物治療手段。椎間盤細(xì)胞的凋亡與衰老是導(dǎo)致椎間盤退變發(fā)生的重要因素。自噬作為細(xì)胞自我更新的重要手段，被認(rèn)為能夠有效的對抗椎間盤細(xì)胞的凋亡與衰老。近年來研究報(bào)道，經(jīng)典抗糖尿病一線藥物二甲雙胍能夠通過上調(diào) AMPK信號通路上調(diào)細(xì)胞自噬而對細(xì)胞凋亡與自噬起著一定作用。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯慷纂p胍對體外髓核細(xì)胞的AMPK信號的活化及自噬激活的作用，同時(shí)研究二甲雙胍對在TBHP誘

2、導(dǎo)下的髓核細(xì)胞凋亡及衰老的影響來進(jìn)一步闡明自噬與凋亡、衰老在椎間盤退變中的作用。
　　方法：
　　體外消化分離并培養(yǎng)SD大鼠的原代椎間盤髓核細(xì)胞，用TBHP誘導(dǎo)造成髓核細(xì)胞體外退變模型并用二甲雙胍進(jìn)行治療后，用CCK8檢測細(xì)胞活性及增殖變化，用western blot法檢測二甲雙胍對髓核細(xì)胞凋亡與衰老水平,AMPK信號活化與自噬激活的變化，采用RT-PCR檢測髓核細(xì)胞中退變相關(guān)基因的變化，采用透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。

3、采用siRNA敲減AMPK基因后，用western blot法檢測自噬水平的變化。再進(jìn)一步用自噬抑制劑3-MA抑制自噬后，采用免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測細(xì)胞凋亡與自噬共存的變化,用Tunel染色檢測髓核細(xì)胞的凋亡情況，用β-半乳糖苷酶染色檢測髓核細(xì)胞的衰老水平，采用RT-PCR與免疫熒光染色檢測基質(zhì)合成與分解蛋白的表達(dá)。最后，在體內(nèi)用針刺纖維環(huán)法制造大鼠椎間盤退變模型。用二甲雙胍腹腔注射治療后，在術(shù)后8周及16周，用磁共振影像評估大鼠椎間盤

4、退變的程度，用番紅-快綠染色檢測椎間盤組織學(xué)退變，采用免疫組化檢測大鼠椎間盤切片的自噬及凋亡情況。
　　結(jié)果：
　　CCK8結(jié)果顯示TBHP處理造成了髓核細(xì)胞的死亡，而高濃度二甲雙胍（100uM）能促進(jìn)髓核細(xì)胞的存活。western blot結(jié)果顯示TBHP使髓核細(xì)胞的凋亡相關(guān)蛋白（cleaved-caspase3）及衰老相關(guān)蛋白（p16INK4a）增加而二甲雙胍處理后，cleaved-caspase3與p16INK4a表達(dá)

5、減少。二甲雙胍處理后，細(xì)胞AMPK信號活化，自噬蛋白（LC3,Beclin-1）表達(dá)增多，自噬底物p62減少，并呈濃度效應(yīng)依賴性。在透射電鏡下顯示，二甲雙胍處理后的髓核細(xì)胞中，自噬小體與自噬溶酶體數(shù)量更多。在使用了siRNA干擾AMPK基因后，western blot結(jié)果顯示二甲雙胍的促自噬激活作用明顯衰減。在使用自噬抑制劑3-MA之后，熒光免疫雙標(biāo)染色（標(biāo)記LC3-2與cleaved-caspase3）結(jié)果顯示，當(dāng)自噬被抑制后，細(xì)胞凋

6、亡水平上升。TUNEL染色顯示，髓核細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯增加，western blot顯示凋亡蛋白 Bax/Bcl-2比值，cleaved-caspase3表達(dá)增加。β-半乳糖苷酶染色顯示細(xì)胞衰老數(shù)量增加，western blot結(jié)果同樣顯示細(xì)胞周期蛋白 p-p53/P53, p21WIFA, p16INK4a蛋白表達(dá)上升。我們同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍促進(jìn)了細(xì)胞外基質(zhì)2型膠原與蛋白聚糖基因的表達(dá)，減少了基質(zhì)降解基因MMP-3與ADAMTS5的

7、表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，磁共振顯示二甲雙胍治療后大鼠椎間盤退變等級減輕，組織學(xué)染色顯示組織退變改善。免疫組化（標(biāo)記LC3-2;cleaved-caspase3）顯示,二甲雙胍促進(jìn)了椎間盤體內(nèi)的自噬水平，減少了凋亡水平。
　　結(jié)論：
　　二甲雙胍抑制由TBHP所誘導(dǎo)的大鼠髓核細(xì)胞的凋亡與細(xì)胞衰老，以及細(xì)胞退變。二甲雙胍可以顯著上調(diào)大鼠髓核細(xì)胞的AMPK信號通路的活化，并激活細(xì)胞自噬水平。通過應(yīng)用siRNA敲減AMPK基因來抑制

8、AMPK的活化可以逆轉(zhuǎn)二甲雙胍所上調(diào)的細(xì)胞自噬的效應(yīng)，因此提示在二甲雙胍對髓核細(xì)胞的自噬激活依賴于AMPK的活化。通過應(yīng)用自噬抑制3-MA抑制自噬激活后，我們發(fā)現(xiàn)了二甲雙胍對于體外髓核細(xì)胞的抗凋亡、抗衰老、延緩?fù)俗兊谋Ｗo(hù)作用明顯減弱。提示二甲雙胍對髓核細(xì)胞在氧化應(yīng)激下的保護(hù)效應(yīng)是基于其自噬水平的激活而起作用。大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以顯著延緩椎間盤退變發(fā)生。我們認(rèn)為，以二甲雙胍或其他的高選擇性 AMPK激動(dòng)藥物作為治療靶點(diǎn)在應(yīng)