microRNA-155在腫瘤進(jìn)展過程中對髓源抑制性細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的調(diào)控作用研究.pdf

1、第一部分：microRNA-155對髓源抑制性細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用研究
　　目的：通過在野生型(wild type，WT)和bic/miR-155基因敲除（miR-155-/-）小鼠體內(nèi)建立黑色素瘤（B16-F10）和肺癌（Lewis lung carcinoma，LLC）模型以及通過體外模擬腫瘤微環(huán)境，比較miR-155表達(dá)水平對荷瘤小鼠髓源抑制性細(xì)胞功能和行為的影響，并揭示其潛在的分子機(jī)制。
　　方法：分別應(yīng)用 WT和 mic

2、roRNA-155(miR-155)全身以及骨髓細(xì)胞特異性敲除（通過骨髓移植建立）的小鼠建立黑色素瘤和肺癌模型，比較腫瘤在不同小鼠體內(nèi)的生長情況以及免疫細(xì)胞成分的差異；應(yīng)用細(xì)胞分選技術(shù)分離純化荷瘤小鼠的髓源抑制性細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）并比較miR-155缺失對其主要功能分子如 Arg-1（arginase-1）和 iNOS(inducible nitric oxide syn

3、thetase)表達(dá)的影響；應(yīng)用trans-well技術(shù)比較miR-155缺失對MDSCs遷移的影響；將MDSCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)研究miR-155表達(dá)水平對MDSCs免疫抑制能力影響；分別從WT和miR-155-/-小鼠獲取腫瘤組織后，用免疫組織化學(xué)染色的方法測定腫瘤組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞CD31的表達(dá)，以此表示腫瘤內(nèi)血管新生能力，同時檢測 WT和 miR-155-/- MDSCs中促血管生成因子如 MMP2（matrix metal

4、loproteinase2）、MMP9以及 VEGF(vascular endothelial growth factor)的表達(dá)。
　　結(jié)果：在bic/miR-155基因敲除小鼠體內(nèi)，兩種實(shí)體腫瘤的生長速度明顯快于WT對照組，同時伴隨MDSCs在腫瘤微環(huán)境中的募集增加。進(jìn)一步的骨髓移植實(shí)驗證明骨髓細(xì)胞特異性 miR-155缺失能夠復(fù)制系統(tǒng)性miR-155敲除引起的促腫瘤生長表型。體外實(shí)驗顯示腫瘤浸潤的miR-155-/- MDS

5、Cs高表達(dá)多種與其遷移有關(guān)的趨化因子，且較 WT MDSCs有更強(qiáng)的遷移能力。除此之外，我們還發(fā)現(xiàn)miR-155的靶分子，HIF-1α（hypoxia induced factor-1α)，在 miR-155缺失的MDSCs表達(dá)增高，通過調(diào)節(jié)趨化因子 CXCL1，CXCL3和 CXCL8的表達(dá)來促進(jìn)MDSCs向腫瘤微環(huán)境遷移。此外，在本課題中，我們還發(fā)現(xiàn)miR-155-/-MDSCs有更強(qiáng)的免疫抑制能力和促進(jìn)血管新生的能力。
　　

6、結(jié)論：在本課題中，我們分別應(yīng)用了 B16-F10黑色素瘤和 LLC肺癌模型，首次揭示了 miR-155的缺失能通過增加 MDSCs向腫瘤微環(huán)境的募集來促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。另外，miR-155缺失的MDSC具有更強(qiáng)的免疫抑制功能和促進(jìn)血管新生的功能。以上發(fā)現(xiàn)提示我們可以運(yùn)用慢病毒、脂質(zhì)體或者納米粒等載體使 MDSCs中miR-155的表達(dá)增高來弱化免疫抑制反應(yīng)、增強(qiáng)免疫細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)，從而全面提高抗腫瘤免疫治療的效果。
　　第二部分：m

7、icroRNA-155在腫瘤進(jìn)展中對樹突狀細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用研究
　　目的：通過在WT和miR-155-/-小鼠體內(nèi)建立原位乳腺癌模型、體外模擬腫瘤微環(huán)境以及通過慢病毒感染途徑獲得 miR-155高表達(dá)的細(xì)胞，比較 miR-155表達(dá)水平對小鼠樹突狀細(xì)胞成熟、遷移能力以及功能的影響，揭示其潛在的分子機(jī)制、探索以miR-155高表達(dá)DC（dendritic cell，樹突狀細(xì)胞）為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療的轉(zhuǎn)化價值。
　　方法：分別在W

8、T和miR-155-/-小鼠體內(nèi)建立原位乳腺癌模型，比較腫瘤在兩組小鼠體內(nèi)的生長情況以及免疫細(xì)胞成分的差異；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)比較miR-155缺失對DC成熟狀態(tài)的影響；將DC與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)研究miR-155缺失的DC功能的影響；將 DC接種于荷瘤小鼠腹股溝區(qū)皮下，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同的DC向腫瘤引流淋巴結(jié)的遷移能力；體外實(shí)驗應(yīng)用腫瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基和腫瘤裂解物刺激BMDCs(bone marrow derived dendritic

9、cells，骨髓來源的樹突狀細(xì)胞)，來研究可溶性免疫抑制因子如IL-6和 IL-10對DC功能的影響；分別應(yīng)用WT、miR-155-/-和miR-155高表達(dá)的BMDCs作為腫瘤治療性疫苗。比較miR-155表達(dá)水平對以DC為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療效果的影響。
　　結(jié)果：我們的研究結(jié)果顯示在乳腺癌中，miR-155在調(diào)控 DC多重功能過程中起著十分重要的作用：DC miR-155表達(dá)水平與其成熟程度、遷移能力、細(xì)胞因子產(chǎn)生能力以及激活

10、 T淋巴細(xì)胞的能力密切相關(guān)。我們也進(jìn)一步揭示了 miR-155通過表觀遺傳學(xué)水平修飾CCR7表達(dá)來調(diào)控DC的遷移。此外，我們也發(fā)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境中廣泛存在的兩種細(xì)胞因子——IL-6和 IL-10，能夠通過下調(diào) DC miR-155的表達(dá)，從而使DC處于相對不成熟的狀態(tài)而無法行使正常的功能。在兩種小鼠乳腺癌模型（EO771/C57BL/6和4T1/Balb/c）中，我們分別證實(shí)了miR-155缺失明顯減低然而 miR-155高表達(dá)能夠顯著增