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文檔簡介
1、由于生理老化和病理損害導致的椎間盤退變(discdegenrativedisease,DDD)常使椎間盤破壞,其破壞后不但可引起椎間盤源性疾病,并將引起脊柱的生物力學紊亂,由椎間盤退變導致的下腰痛是現(xiàn)代社會中的常見問題。椎間盤是脊柱運動功能單位中最關鍵的結構,椎間盤在維持椎體關節(jié)穩(wěn)定、充分發(fā)揮順應性、緩沖及吸振、防止脆性等方面起著重要的作用。而上述力學性能的維持和發(fā)展有賴于椎間盤細胞及其外在基質(zhì)特殊的生物材料成分、比例及功能結構。椎間盤
2、退變是以椎間盤變性、椎體力學性能異常為始發(fā)因素的一個連續(xù)過程,椎間盤退變引起椎體退變生物力學改變的研究已較為深入,但分子生物學機制至今還不清楚。 金屬蛋白酶是椎間盤退變中發(fā)揮作用的最重要的一組酶,MMP-1、MMP-2、MMP-3、Timp-1、Timp-2等基因被發(fā)現(xiàn)與人類椎間盤退變關系密切,而且各基因之間有相互拮抗抑制作用,關于MMPs/Timps在椎間盤退變過程中的表達情況目前還沒有統(tǒng)一的結論。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)細
3、胞凋亡在椎間盤的衰老和退變中起重要作用,F(xiàn)as是位于細胞膜上Ⅰ型跨膜糖蛋白,又稱Apo-1或CD95,是一條已被公認的程序性細胞死亡信號傳遞通路,當Fas與FasL或Fas抗體結合時,F(xiàn)as可導致細胞調(diào)亡?;蚨鄳B(tài)性(polymorphism)的產(chǎn)生源于基因水平上的變異,F(xiàn)as蛋白表達增高或缺失可使細胞的凋亡變化,因此凋亡與增殖失衡會導致疾病的發(fā)生。 在分子水平證實動物退變模型與人類的相似性對進一步研究纖維環(huán)破裂導致腰椎退變的致
4、病基因提供了理論基礎,并且為椎間盤退變的基因治療方面的研究提供試驗載體。為探討Fas、MMP/Timp在椎間盤退變中的作用機制,本試驗制作新西蘭大白兔DDD模型,并從四個方面進行研究:①制作腰椎間盤退變動物模型;②對比動物模型椎間盤MMP/Timp系列退變?nèi)袒虻淖兓?;③Fas在退變的椎間盤終板凋亡中的表達及作用通路;④漢族腰椎間盤退變?nèi)巳褐蠪as-670的基因多態(tài)性。 第一部分建立腰椎間盤退變動物模型 目的:建立腰椎
5、間盤退變的動物模型并進行CR和MRI觀察。方法:選用新西蘭兔20只,沿右腹直肌外緣做15cm長切口,鈍性剝離腹膜至腰椎橫突前外側(cè),咬除右側(cè)腰5、腰6橫突,顯露上述節(jié)段椎間盤,斜形切開纖維環(huán)約1.5mm,未傷及髓核,然后逐層縫合。所有動物在標準條件下飼養(yǎng),分別于術后2、4、8、20、40周行腰椎計算機X線攝影術(computerradioactivate,CR)和核磁共振成像(magneticresonanceimaging,MRI)以檢
6、測終板下骨及髓核的變化。結果:術后作為自體對照組的L1./2、L2/3椎間盤未見異常,而手術組L4/5、L5/6椎間盤則相繼出現(xiàn)T2加權像低信號、腰椎不穩(wěn)畸形,終板下骨質(zhì)硬化,椎體邊緣骨贅增生,椎間隙變窄,椎間盤后突和硬膜囊受壓等改變。對手術節(jié)段及其鄰近和完全正常節(jié)段椎間盤髓核信號值的定量分析顯示,手術組椎間盤T2加權像信號值減低在術后4周、8周、20周、40周與正常對照組對比具有統(tǒng)計學意義,而臨近椎間盤L3/4、L6/7手術8周后與正
7、常椎間盤對比有顯著差異。CR掃描結果顯示:手術節(jié)段椎間盤終板下信號值減低與對照組相比4周后就開始有顯著差異。結論:應用纖維環(huán)切開法可獲得可靠的新西蘭大白兔椎間盤退變模型,可通過MRI及CR在早期加以證實。 第二部分動物模型椎間盤MMP/Timp系列退變?nèi)袒蜃兓膶Ρ?目的:損傷新西蘭大白兔的纖維環(huán)制作腰椎間盤退變模型,用以證實和比較在人椎間盤退變中明顯的基因變化情況。方法:20只新西蘭大白兔纖維環(huán)損傷腰4*5及腰5*
8、6作為實驗組,4只作對照組未行損傷。2周、4周、8周、40周、分別行核磁共振及計算機掃描攝影拍片證實椎間盤退變情況同時取椎間盤行精確定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應檢測MMP-1、MMP-2、MMP-3及它們的特異性抑制劑Timp-1、Timp-2的變化。結果:核磁共振及計算機掃描攝影證實了腰椎纖維環(huán)損傷后腰椎逐漸退變并與人類退變結果相似,基因表達情況MMP-1、MMP-2、MMP-3、Timp-1、Timp-2早期均上調(diào),MMP-3、Timp
9、-1在退變的晚期出現(xiàn)下調(diào)。結論:纖維環(huán)損傷可以成功制作出椎間盤退變的模型。在人類腰椎間盤退變中明顯上調(diào)的基因在此退變模型椎間盤中被發(fā)現(xiàn)同樣上調(diào),從而在分子水平證實了動物退變模型與人類的相似性,此實驗為進一步研究纖維環(huán)破裂致病基因提供了堅實基礎。 第三部分Fas在退變的椎間盤終板凋亡中的表達及作用通路 目的:探討Fas在退變的新西蘭大白兔退變椎間盤的終板凋亡中的表達及作用通路。方法:10只新西蘭大白兔纖維環(huán)損傷腰4*5及腰
10、5*6作為實驗組,10只作對照組未行損傷。8周時分別行流式細胞儀、熒光共聚焦顯微鏡證實退變椎間盤終板中的細胞凋亡情況,同時取終板行精確定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應檢測Fas、細胞凋亡蛋白酶3(caspase-3)的變化。結果:流式細胞儀、熒光共聚焦顯微鏡證實了腰椎纖維環(huán)損傷后退變腰椎中軟骨終板細胞的凋亡增加,和對照組相比Fas、caspase-3均出現(xiàn)明顯上調(diào)。結論:腰椎退變中軟骨終板的凋亡是可以通過Fas-caspase-3途徑進行。
11、 第四部分漢族腰椎間盤退變?nèi)巳褐蠪as-670的基因多態(tài)性 目的:研究Fas-670基因多態(tài)性在中國地區(qū)漢族人群中的分布及其與椎間盤退變性疾病(DDD)的相關性。方法:應用聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)方法,對223例DDD患者和124例中國南方地區(qū)漢族正常對照者進行了Fas基因
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