人巨細(xì)胞病毒UL82基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達(dá).pdf

1、人巨細(xì)胞病毒(HCMV)含有約20-25種蛋白質(zhì),其中在介導(dǎo)HCMV感染和病毒復(fù)制中有3種蛋白作用最為重要,即由ORFUL82編碼的磷蛋白pp71、ORF UL83編碼的pp65蛋白和ORF UL69編碼的pUL69蛋白.上述3種蛋白共同的特點(diǎn)是啟動(dòng)HCMV對(duì)宿主細(xì)胞的感染和病毒的復(fù)制,同時(shí)在逃逸T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用中也具有重要作用.新近的研究表明,在這3種間層蛋白中以O(shè)RFUL82編碼的蛋白pp71的作用最為顯著,該P(yáng)P71蛋

2、白單獨(dú)存在時(shí),是一種較強(qiáng)的抗原蛋白,可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,有助于清除病毒;在器官移植者,HCMV的感染后pp71蛋白的產(chǎn)生可以明顯增強(qiáng)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達(dá),從而引起移植物血管病變和排斥反應(yīng)<'[1]>;在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤,pp71蛋白的產(chǎn)生可以引起腫瘤蛋白p105,p107,p130等的衰變<'[2,3]>.Pp71蛋白可以誘導(dǎo)靜止的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并使他們停在G1晚期,而這段時(shí)期對(duì)病毒復(fù)制最為有利,所以它能夠增加病毒繁

3、殖,加快病毒在細(xì)胞間傳遞,體外將HCMV轉(zhuǎn)染人纖維母細(xì)胞后,病毒DNA復(fù)制效率在共轉(zhuǎn)染ORF UL82(pp71蛋白)條件下,感染及復(fù)制效率增加了80倍<'[4~8]>.研究證實(shí)pp71不僅對(duì)HCMV的IE1和IE2基因表達(dá)有促進(jìn)作用,而且對(duì)晚期基因的表達(dá)以及病毒向正常宿主細(xì)胞的傳播具有促進(jìn)和加強(qiáng)作用.因此,Baldick指出,ORF UL82(pp71蛋白)可作為抗CMV病毒藥物設(shè)計(jì)的有效靶點(diǎn)<'[9]>.為了進(jìn)一步研究PP71蛋白基

4、因在大腸桿菌(E.coli)中的表達(dá),為下一步蛋白的大量表達(dá)純化和基因工程抗體庫(kù)的篩選奠定基礎(chǔ).該研究進(jìn)行了以下工作:1. 人巨細(xì)胞病毒的培養(yǎng)..在傳代培養(yǎng)的人包皮成纖維細(xì)胞(HFF)中接種人巨細(xì)胞病毒,并在含2﹪小牛血清的DMEM維持液中繼續(xù)培養(yǎng)至絕大多數(shù)的細(xì)胞都出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)時(shí),凍融法收獲細(xì)胞,保存在-70℃.免疫組化方法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中的pp65抗原顯示絕大多數(shù)的細(xì)胞已經(jīng)成功感染了巨細(xì)胞病毒.2. 人巨細(xì)胞病毒p

5、p71基因的克隆及pGEX/pp71重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(1)利用蛋白酶K法提取HCMV DNA.(2)設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增pp71基因目的片段.(3)BamHI和EcoRI內(nèi)切酶雙酶切目的片段和質(zhì)粒pGEX-4T-1.并將pp71基因目的片段連接到pGEX-4T-1上.利用氯化鈣法將重組質(zhì)粒pGEX/pp71轉(zhuǎn)入DH5a大腸桿菌內(nèi).(4)提取重組質(zhì)粒pGEX/pp71,以BamHI和EcoRI雙酶切方法和PCR方法初步鑒定重組質(zhì)粒,