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1、棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物,利用棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility,CMS)系培育棉花雜交品種成為當(dāng)今世界棉花育種的主攻方向,且能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。由于高等植物的細(xì)胞質(zhì)雄性不育性與線粒體DNA有密切關(guān)系,因此克隆棉花不育系線粒體基因,為進(jìn)一步研究棉花不育系線粒體DNA的結(jié)構(gòu),對(duì)于分析棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理具有重要的理論意義。 在本實(shí)驗(yàn)中,以棉花不育系P53A的黃化苗為材料提取線粒體
2、DNA。所提取的線粒體DNA的瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果表明,線粒體DNA純度較高,無(wú)降解現(xiàn)象,可用作后續(xù)試驗(yàn)。根據(jù)不同植物的線粒體同源基因(orfB、coxl、nad4L、atp6、cox3、cob、nad9、rps12、atp9、matr和atpA)的保守序列設(shè)計(jì)了11對(duì)特異引物(ob、c1、n4、a6、c3、cb、n9、11)、a9、mr和aa)。經(jīng)PCR擴(kuò)增,11對(duì)引物都得到了較清晰的預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物,克隆后挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。
3、 通過(guò)檢索NCBI核酸及蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)及DNAstar軟件分析序列,結(jié)果表明,ob序列與不同作物線粒體orfB基因的同源性達(dá)92﹪以上,與ORFB(ATP酶復(fù)合體亞基相關(guān))蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)88﹪以上;c1序列與不同作物線粒體coxl基因的同源性達(dá)96﹪以上,與COXI(線粒體細(xì)胞色素氧化酶復(fù)合體亞基1)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)98﹪以上;n4序列與不同作物線粒體nad4L基因的同源性達(dá)96﹪以上,與NAD4L(NADH脫氫酶亞基4L
4、)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)93﹪以上;a6序列與不同作物線粒體atp6基因的同源性達(dá)94﹪以上,與ATP6(線粒體ATP酶復(fù)合體亞基6)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)93﹪以上;c3序列與不同作物線粒體cox3基因的同源性達(dá)94﹪以上,與COX3(線粒體細(xì)胞色素氧化酶復(fù)合體亞基)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)96﹪以上;cb序列與不同作物線粒體cob基因的同源性達(dá)98﹪以上,與COB(脫輔基細(xì)胞色素B)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)97﹪以上:n9序列與
5、不同作物線粒體nad9基因的同源性達(dá)98﹪以上,與NAD9(NADH脫氫酶亞基9)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)97﹪以上;rp序列與不同作物線粒體rps12基因的同源性達(dá)97﹪以上,與RPS12(核糖體蛋白S12)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)94﹪以上;a9序列與不同作物線粒體atp9基因的同源性達(dá)95﹪以上,與ATP9(線粒體ATP酶復(fù)合體亞基9)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)93﹪以上。但是,mr和aa序列經(jīng)比對(duì)同源性很低,認(rèn)為是假陽(yáng)性克隆。
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