棉花不育系線粒體相關(guān)基因及片段的克隆與序列分析.pdf

1、棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，利用棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)系培育棉花雜交品種成為當(dāng)今世界棉花育種的主攻方向，且能產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。由于高等植物的細(xì)胞質(zhì)雄性不育性與線粒體DNA有密切關(guān)系，因此克隆棉花不育系線粒體基因，為進(jìn)一步研究棉花不育系線粒體DNA的結(jié)構(gòu)，對(duì)于分析棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育機(jī)理具有重要的理論意義。 在本實(shí)驗(yàn)中，以棉花不育系P53A的黃化苗為材料提取線粒體

2、DNA。所提取的線粒體DNA的瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果表明，線粒體DNA純度較高，無(wú)降解現(xiàn)象，可用作后續(xù)試驗(yàn)。根據(jù)不同植物的線粒體同源基因(orfB、coxl、nad4L、atp6、cox3、cob、nad9、rps12、atp9、matr和atpA)的保守序列設(shè)計(jì)了11對(duì)特異引物(ob、c1、n4、a6、c3、cb、n9、11)、a9、mr和aa)。經(jīng)PCR擴(kuò)增，11對(duì)引物都得到了較清晰的預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆后挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

3、 通過(guò)檢索NCBI核酸及蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)及DNAstar軟件分析序列，結(jié)果表明，ob序列與不同作物線粒體orfB基因的同源性達(dá)92﹪以上，與ORFB(ATP酶復(fù)合體亞基相關(guān))蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)88﹪以上；c1序列與不同作物線粒體coxl基因的同源性達(dá)96﹪以上，與COXI(線粒體細(xì)胞色素氧化酶復(fù)合體亞基1)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)98﹪以上；n4序列與不同作物線粒體nad4L基因的同源性達(dá)96﹪以上，與NAD4L(NADH脫氫酶亞基4L

4、)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)93﹪以上；a6序列與不同作物線粒體atp6基因的同源性達(dá)94﹪以上，與ATP6(線粒體ATP酶復(fù)合體亞基6)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)93﹪以上；c3序列與不同作物線粒體cox3基因的同源性達(dá)94﹪以上，與COX3(線粒體細(xì)胞色素氧化酶復(fù)合體亞基)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)96﹪以上；cb序列與不同作物線粒體cob基因的同源性達(dá)98﹪以上，與COB(脫輔基細(xì)胞色素B)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)97﹪以上：n9序列與

5、不同作物線粒體nad9基因的同源性達(dá)98﹪以上，與NAD9(NADH脫氫酶亞基9)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)97﹪以上；rp序列與不同作物線粒體rps12基因的同源性達(dá)97﹪以上，與RPS12(核糖體蛋白S12)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)94﹪以上；a9序列與不同作物線粒體atp9基因的同源性達(dá)95﹪以上，與ATP9(線粒體ATP酶復(fù)合體亞基9)蛋白氨基酸序列的同源性達(dá)93﹪以上。但是，mr和aa序列經(jīng)比對(duì)同源性很低，認(rèn)為是假陽(yáng)性克隆。