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文檔簡介
1、目的:
通過干擾瘢痕相關(guān)基因整合素蛋白β5(β5-Integrin,ITGB5)的表達(dá),觀察該基因?qū)︸:鄹泶癯衫w維細(xì)胞(Keloid Fibroblast,KFb)的細(xì)胞周期、增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的影響,闡明ITGB5基因在瘢痕疙瘩形成及發(fā)展中的相關(guān)作用,以期為瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制研究提供理論依據(jù)、為臨床探尋瘢痕疙瘩的治療靶點(diǎn)研究提供先期實(shí)驗(yàn)工作。
方法:
1.構(gòu)建干擾人ITGB5基因表達(dá)慢病毒載體(l
2、entiviral vector, LV);
2.將培養(yǎng)好的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為三組,分別為ITGB5干擾慢病毒載體感染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞組(LV-KFb),空載病毒感染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞組(LV-NC)及空白對照組(KFb),用慢病毒持續(xù)感染LV-KFb組及LV-NC組細(xì)胞,流式細(xì)胞儀篩選穩(wěn)定細(xì)胞株;
3.Real-time PCR及Westem Blot檢測慢病毒載體感染后各組細(xì)胞中ITGB5基因及蛋白的表
3、達(dá)情況;
4.MTT法檢測慢病毒載體感染后各組細(xì)胞的增殖情況;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡情況;Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲及遷移能力變化;
5.利用免疫共沉淀技術(shù)檢測轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming Growth Factor-β,TGF-β)及ITGB5間的相互作用。
結(jié)果:
1.干擾人ITGB5慢病毒載體可以成功感染KFb,且在MOI=50時細(xì)胞感染率可達(dá)80%,通過FCM可獲
4、得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株;
2.慢病毒感染KFb后,KFb組、LV-NC組及LV-KFb組中ITGB5 mRNA及蛋白的表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.08±0.05及0.34±0.01和0.91±0.03、0.93±0.02及0.28±0.07,與LV-NC組及KFb組比較,LV-KFb組中ITGB5 mRNA及蛋白的表達(dá)量均明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);
3.慢病毒感染KFb后,各組間細(xì)胞的增殖情況在接種后
5、24h無顯著差異,48h后,LV-KFb組的增殖較其它兩組明顯變慢(P<0.01);
4.慢病毒感染KFb后,KFb組、LV-NC組和LV-KFb組早期凋亡細(xì)胞所占百分比分別為5.94±0.28、6.08±0.35、13.81±0.46,晚期凋亡細(xì)胞所占百分比分別為18.75±0.93、13.36±1.35、31.30±1.67,LV-KFb組較其它兩組早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);
6、> 5.慢病毒感染KFb后,KFb組、LV-NC組和LV-KFb組S期細(xì)胞所占百分比分別為34.86±1.86、34.03±2.14、20.03±1.32,LV-KFb組較其它兩組S期細(xì)胞所占比例明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);
6.慢病毒感染KFb后, LV-KFb組的穿膜細(xì)胞數(shù)在遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)中均明顯少于其它兩組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);
7.ITGB5及TGF-β的陽性條帶在免疫共沉淀中
7、均能被檢測到。
結(jié)論:
1.成功構(gòu)建了干擾人ITGB5基因表達(dá)慢病毒載體;
2.成功獲得了慢病毒感染KFb的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株;
3.干擾人ITGB5慢病毒能夠成功感染KFb并能有效抑制細(xì)胞中ITGB5mRNA和蛋白的表達(dá);
4.ITGB5能夠促進(jìn)KFb的細(xì)胞分裂、增殖、遷移和侵襲能力,抑制KFb的凋亡;
5.ITGB5對KFb的作用可能通過TGF-β信號通路實(shí)現(xiàn);
6.IT
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