干擾人ITGB5基因表達(dá)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的:
　　通過干擾瘢痕相關(guān)基因整合素蛋白β5（β5-Integrin，ITGB5）的表達(dá)，觀察該基因?qū)︸：鄹泶癯衫w維細(xì)胞(Keloid Fibroblast，KFb)的細(xì)胞周期、增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的影響，闡明ITGB5基因在瘢痕疙瘩形成及發(fā)展中的相關(guān)作用，以期為瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制研究提供理論依據(jù)、為臨床探尋瘢痕疙瘩的治療靶點(diǎn)研究提供先期實(shí)驗(yàn)工作。
　　方法:
　　1.構(gòu)建干擾人ITGB5基因表達(dá)慢病毒載體(l

2、entiviral vector, LV);
　　2.將培養(yǎng)好的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞隨機(jī)分為三組，分別為ITGB5干擾慢病毒載體感染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞組(LV-KFb)，空載病毒感染瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞組（LV-NC）及空白對照組(KFb)，用慢病毒持續(xù)感染LV-KFb組及LV-NC組細(xì)胞，流式細(xì)胞儀篩選穩(wěn)定細(xì)胞株;
　　3.Real-time PCR及Westem Blot檢測慢病毒載體感染后各組細(xì)胞中ITGB5基因及蛋白的表

3、達(dá)情況;
　　4.MTT法檢測慢病毒載體感染后各組細(xì)胞的增殖情況;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡情況;Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲及遷移能力變化;
　　5.利用免疫共沉淀技術(shù)檢測轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming Growth Factor-β，TGF-β)及ITGB5間的相互作用。
　　結(jié)果:
　　1.干擾人ITGB5慢病毒載體可以成功感染KFb，且在MOI=50時細(xì)胞感染率可達(dá)80％，通過FCM可獲

4、得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株;
　　2.慢病毒感染KFb后，KFb組、LV-NC組及LV-KFb組中ITGB5 mRNA及蛋白的表達(dá)量分別為1.00±0.00、1.08±0.05及0.34±0.01和0.91±0.03、0.93±0.02及0.28±0.07，與LV-NC組及KFb組比較，LV-KFb組中ITGB5 mRNA及蛋白的表達(dá)量均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);
　　3.慢病毒感染KFb后，各組間細(xì)胞的增殖情況在接種后

5、24h無顯著差異，48h后，LV-KFb組的增殖較其它兩組明顯變慢(P＜0.01);
　　4.慢病毒感染KFb后，KFb組、LV-NC組和LV-KFb組早期凋亡細(xì)胞所占百分比分別為5.94±0.28、6.08±0.35、13.81±0.46，晚期凋亡細(xì)胞所占百分比分別為18.75±0.93、13.36±1.35、31.30±1.67，LV-KFb組較其它兩組早期凋亡及晚期凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);

6、>　　5.慢病毒感染KFb后，KFb組、LV-NC組和LV-KFb組S期細(xì)胞所占百分比分別為34.86±1.86、34.03±2.14、20.03±1.32，LV-KFb組較其它兩組S期細(xì)胞所占比例明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);
　　6.慢病毒感染KFb后， LV-KFb組的穿膜細(xì)胞數(shù)在遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)中均明顯少于其它兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);
　　7.ITGB5及TGF-β的陽性條帶在免疫共沉淀中

7、均能被檢測到。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建了干擾人ITGB5基因表達(dá)慢病毒載體;
　　2.成功獲得了慢病毒感染KFb的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株;
　　3.干擾人ITGB5慢病毒能夠成功感染KFb并能有效抑制細(xì)胞中ITGB5mRNA和蛋白的表達(dá);
　　4.ITGB5能夠促進(jìn)KFb的細(xì)胞分裂、增殖、遷移和侵襲能力，抑制KFb的凋亡;
　　5.ITGB5對KFb的作用可能通過TGF-β信號通路實(shí)現(xiàn);
　　6.IT