老齡骨質(zhì)疏松BMSC成骨分化中Integrinα2的異常調(diào)控作用.pdf

1、骨質(zhì)疏松的定義為骨量降低和骨結(jié)構(gòu)惡化,這些可以導(dǎo)致骨組織脆性增加及病理性骨折增多。在骨的微環(huán)境中成骨細胞帶來的骨形成及破骨細胞帶來的骨吸收式骨質(zhì)疏松形成的病理過程,該過程涉及到多種內(nèi)源性(如基因和激素)和外源性(如營養(yǎng)和功能鍛煉)因素來共同調(diào)節(jié)骨組織的重構(gòu)。盡管骨質(zhì)疏松的危險因素可以通過生活狀態(tài)(飲食和合理的功能鍛煉),藥物(鈣劑,維生素D,激素替代藥物)治療來防范,但是,骨質(zhì)疏松骨折帶來的殘疾和死亡仍然嚴重的影響老年人口尤其是65歲以

2、上老年人生命質(zhì)量的。目前老齡骨質(zhì)疏松癥的分子調(diào)控機制尚不完全清楚,因此我們的研究排除了性激素及糖皮質(zhì)激素的影響而主要關(guān)注著男性老齡骨質(zhì)疏松癥的病理機制和過程。
　　之前的研究顯示在骨重建過程中骨形成的缺陷使老齡骨質(zhì)疏松癥的主要病理機制。骨髓中的骨髓基質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal cells,BMSCs)是成人骨重建中成骨前體細胞的主要來源,因此了解調(diào)控老齡骨質(zhì)疏松患者BMSCs成骨分化的調(diào)控機制并強化其

3、成骨分化能力是進一步探索骨質(zhì)疏松癥診斷和治療的關(guān)鍵。
　　整合素α和β跨膜結(jié)構(gòu)可以觸發(fā)及調(diào)節(jié)細胞的粘附及分化過程,其是細胞同周圍大分子基質(zhì)環(huán)境相互作用的重要調(diào)節(jié)因子。之前的研究顯示整合素αV,α5β1,αvβ3和β3/β5參與了成骨細胞同周圍大分子基質(zhì)環(huán)境相互作用從而影響了成骨細胞的功能及骨重建的過程。在成骨分化過程中如果使用整合素α5或β1抗體干預(yù)可以使成骨細胞的礦化減少大約20％和45%,相應(yīng)的αVβ3抗體干預(yù)可以減少大概65

4、%,α2β1抗體干預(yù)可以減少近95%。此外,在人BMSCs成骨分化中整合素α2β1,α5β1及αVβ3可以活化細胞內(nèi)信號通道及隨后的堿性磷酸酶和骨鈣素表達。整合素在老齡骨質(zhì)疏松中的分布特點及調(diào)控機制尚未明確,因此我們研究了老齡骨質(zhì)疏松癥患者BMSCs上整合素的表達特點和作用。
　　【目的】
　　1、老齡骨疏患者 BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及成骨能力檢測;2、老齡骨質(zhì)疏松患者BMSCs整合素表達特點的研究;3、構(gòu)建和包裝帶有

5、Integrinα2慢病毒載體,包裝成慢病毒后轉(zhuǎn)染上述 BMSCs;4、觀察轉(zhuǎn)染后生物學功能、成骨能力及相關(guān)下游通道改變情況,明確Integrinα2調(diào)控老齡骨質(zhì)疏松患者BMSCs成骨分化分子機制。
　　【方法】
　　1、利用分層離心技術(shù)對捐獻者骨髓細胞進行分離,培養(yǎng)后擴增,流式細胞技術(shù)對培養(yǎng)細胞的表面分子進行測定,誘導(dǎo)分化技術(shù)驗證其向骨、脂肪分化的功能,MTT及CFU-F測定細胞增殖能力;2、利用RT-PCR方法檢測骨疏及

6、正常intergrinβ1,β3,α2,α5,αv表達情況差異,成骨誘導(dǎo)過程中β1,α2的變化同成骨相關(guān)基因(ALP/RUNX2/OSTERIX)變化相關(guān)性;3采用 DNA連接技術(shù)、酶切鑒定技術(shù)等構(gòu)建intergrinα2質(zhì)粒,包裝慢病毒后轉(zhuǎn)染BMSCs,免疫熒光鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件以達到最大轉(zhuǎn)染率;4、利用 RT-PCR、MTT、流式細胞技術(shù)、細胞分化技術(shù)、免疫熒光技術(shù)、堿性磷酸酶染色、茜素紅染色技術(shù)對轉(zhuǎn)染后的BMSCs的生物學

7、特性和成骨分化能力進行檢測;檢測轉(zhuǎn)染后成骨誘導(dǎo)條件下ERK-p,Pi3K-p,P38、JNK相關(guān)信號通道同成骨活性的相關(guān)變化,并進一步檢驗及變化通道的上下游變化,通過干預(yù)上游信號驗證關(guān)鍵通道。
　　【結(jié)果】
　　1.老齡骨疏患者BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及成骨能力檢測
　　采用密度梯度離心法分離了志愿者捐獻的骨髓,15cm培養(yǎng)板貼壁培養(yǎng)后擴增,流式細胞技術(shù)檢測培養(yǎng)細胞表達細胞CD135、CD105,不表達CD34、C

8、D45,CFU-F實驗證明其具有單細胞增殖能力,分化實驗表明其能夠向骨和脂肪組織分化,這些都表明老齡骨疏同非骨疏人間充質(zhì)干細胞具有相同的細胞表型,均具有多向分化潛能,但骨疏患者的細胞增殖及成骨分化能力較弱。
　　2.老齡骨質(zhì)疏松患者BMSCs整合素表達特點
　　我們檢測發(fā)現(xiàn)老齡骨疏患者BMSCsβ1,α2明顯降低、誘導(dǎo)后3、7、14天β1,α2增高亦低于非骨質(zhì)疏松者,且α2這種變化同成骨相關(guān)基因（ALP/RUNX2/OSTE

9、RIX)變化關(guān)系更緊密,這些結(jié)果提示:α2在成骨分化中有重要作用,老齡骨疏患者的α2缺陷是成骨能力降低的重要原因。
　　3.成功構(gòu)建帶有α2的質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達含上述基因的老齡骨疏患者BMSCsα2在成骨分化中有重要作用,因此上調(diào)老齡骨疏患者BMSCs上的α2可能促進
　　BMSCs向成骨分化。構(gòu)建帶有α2基因的慢病毒,轉(zhuǎn)染BMSCs發(fā)現(xiàn)α2表達增高,優(yōu)化上述轉(zhuǎn)染條件,使轉(zhuǎn)染效率達到最高。
　　4.體內(nèi)外實驗證明轉(zhuǎn)染

10、α2基因的老齡骨疏患者BMSCs的ERK基因表達上調(diào),從而使成骨分化能力增強
　　為檢測骨質(zhì)疏松患者BMSC整合素α2高表達對成骨分化的影響我們將轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細胞鋪板,培養(yǎng)一周后加入成骨誘導(dǎo)劑,發(fā)現(xiàn)同野生型對比轉(zhuǎn)染后 RUNX2及Osterix表達明顯增加,ALP活性平均增加43.6%(3 days),58.03%(7 days)和60.42%(14 days),同樣的茜素紅染色證明轉(zhuǎn)染整合素α2可以增強骨疏BMSC的礦化能力,定

11、量分析發(fā)現(xiàn)礦化能力增加了40.83%(14 days)和54.79%(21 days)。結(jié)果提示骨質(zhì)疏松患者BMSC整合素α2高表達促進了細胞增殖及成骨分化。
　　為了明確骨質(zhì)疏松患者 BMSC整合素α2高表達對成骨及增殖的影響的作用機制,我們檢測了整合素下游信號通路ERK/AKT/JNK/P38的磷酸化狀態(tài),發(fā)現(xiàn)成骨誘導(dǎo)分化后轉(zhuǎn)染組ERK在成骨誘導(dǎo)后30 min快速活化。轉(zhuǎn)染后RUNX2、ALP活性和茜素紅染色增強可以被ERK通

12、道阻滯劑PD98059所抑制。
　　【結(jié)論】
　　本研究發(fā)現(xiàn)老齡骨疏hBMSCs上Integrinα2的異常下調(diào)可以導(dǎo)致其增殖及成骨分化能力的降低。進一步的機制研究提示老齡骨疏患者BMSCs成骨及增殖缺陷可以通過高表達α2基因得到修復(fù),Integrinα2活化了下游的ERK通道,從而使目的基因Runx2高表達來促進細胞的成骨分化。總而言之,我們的研究結(jié)果提示 Integrinα2/ERK/Runx2信號通路在老齡骨疏發(fā)病中具