miR-705對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化功能異常的調(diào)控作用.pdf

1、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis,OPM)是由雌激素水平下降導(dǎo)致的一種全身性代謝性骨疾病,我國(guó)老年女性O(shè)PM發(fā)病率達(dá)50％。其發(fā)病根本原因是由于破骨細(xì)胞性骨吸收與成骨細(xì)胞性骨形成平衡的失調(diào),造成骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)變化,使得骨脆性增加,從而導(dǎo)致骨折的發(fā)生。并且骨質(zhì)疏松癥(OP)是造成頜骨骨丟失主要危險(xiǎn)因素之一(1),繼而導(dǎo)致牙槽骨吸收、牙齦萎縮、牙根暴露、基牙附著喪失、基牙的松動(dòng)脫落和頜骨萎縮等一系

2、列不利于口腔修復(fù)問題,給口腔義齒修復(fù)和種植修復(fù)工作帶來(lái)了極大的困難。然而目前臨床治療OPM主要采取激素替代、補(bǔ)鈣、抑制骨吸收等方法,但由于藥物毒副作用、吸收不良、藥效不穩(wěn)定、患者順應(yīng)性差等原因,治療效果尚不理想。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)是一種來(lái)源于中胚層的具有自我更新及多向分化潛能的成體干細(xì)胞,通過分化為成骨細(xì)胞而在骨發(fā)育、再生和修

3、復(fù)中發(fā)揮重要作用。BMMSCs同時(shí)是成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的來(lái)源細(xì)胞,其成骨-成脂分化能力的平衡與骨改建的穩(wěn)態(tài)平衡密切相關(guān)。在骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中,BMMSCs成骨分化能力降低而成脂分化能力升高,可能是引發(fā)骨質(zhì)疏松的原因之一。但對(duì)于BMMSCs多向分化的具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。
　　microRNA(miRNA)即小 RNA是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于動(dòng)物植物體內(nèi)的非編碼小RNA,能夠以堿基配對(duì)方式與靶基因mRNA3′-非翻譯區(qū)結(jié)合,在

4、轉(zhuǎn)錄后水平沉默靶基因的表達(dá),而在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種miRNA均參與干細(xì)胞的成骨成脂分化過程,對(duì)于干細(xì)胞命運(yùn)起著重要調(diào)控作用。但是,對(duì)于哪些miRNA在BMMSCs中的多向分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用,miRNA調(diào)控BMMSCs分化的分子信號(hào)途徑,以及miRNA是否在OPM的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮作用等問題,現(xiàn)在仍不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)利用從正常小鼠和骨質(zhì)疏松模型小鼠中分離純化的BMMSCs,進(jìn)行生物學(xué)行為比較及mi

5、croRNA微陣列芯片分析,尋找差異性表達(dá)的microRNA并進(jìn)行功能研究,探討特定microRNA在OPM發(fā)病中的作用,從而進(jìn)一步既加深了對(duì)OPM發(fā)病分子機(jī)制的理解和明確頜骨骨丟失的根本原因,又為頜骨骨丟失的預(yù)防和治療提供了新的思路和方法,進(jìn)而對(duì)臨床中OPM患者口腔修復(fù)設(shè)計(jì)方案的選擇提供了重要的指導(dǎo)作用。
　　研究目的：
　　(1)探討骨質(zhì)疏松來(lái)源的BMMSCs成骨成脂分化能力的改變。
　　(2)探討骨質(zhì)疏松來(lái)源的B

6、MMSCs中microRNA表達(dá)譜的變化,尋找出差異性表達(dá)的microRNA。
　　(3)探討差異性表達(dá)microRNA在BMMSCs成骨成脂分化中所起的作用,并明確其作用的靶基因和分子機(jī)制。
　　(4)探討通過恢復(fù)差異表達(dá)的microRNA的正常表達(dá)水平,能否逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松來(lái)源的BMMSCs的異常成骨成脂分化。
　　研究方法：
　　(1)采用卵巢切除法成功建立OPM小鼠模型,使用全骨髓法分離培養(yǎng)骨質(zhì)疏松來(lái)源的BM

7、MSCs(O-BMMSCs)和假手術(shù)來(lái)源的BMMSCs(S-BMMSCs),通過流式細(xì)胞術(shù)表面分子鑒定、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期檢測(cè)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、多向分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),比較兩種干細(xì)胞的生物學(xué)特性。
　　(2)通過 miRNA微陣列芯片檢測(cè) O-BMMSCs和 S-BMMSCs的miRNA表達(dá)譜,利用real-time qRT-PCR法對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,挑選出差異表達(dá)miRNA。
　　(3)采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)和抑制 miR-70

8、5在BMMSCs中的表達(dá)水平,并利用MTT、多向分化誘導(dǎo)、茜素紅染色、油紅O染色、qRT-PCR及Western blot,檢測(cè)miRNA對(duì)BMMSCs增殖及成骨成脂分化能力的調(diào)控作用。并通過靶基因預(yù)測(cè)軟件和生物信息學(xué)網(wǎng)站挑選 miR-705的候選靶基因,構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體進(jìn)行靶基因驗(yàn)證。
　　(4)采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)miR-705在O-BMMSCs中的表達(dá)水平,采用油紅O染色、茜素紅染色、qRT-PCR法和Western

9、 blot技術(shù)分別觀察其對(duì)于O-BMMSCs異常成骨和成脂分化的逆轉(zhuǎn)作用。
　　研究結(jié)果：
　　(1)兩種來(lái)源的BMMSCs均表達(dá)正常的間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志,不表達(dá)造血系統(tǒng)來(lái)源細(xì)胞表面標(biāo)志,并具有克隆形成能力?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)、細(xì)胞擴(kuò)增曲線和細(xì)胞周期檢測(cè)顯示 O-BMMSCs自我更新能力略低于 S-BMMSCs。成骨誘導(dǎo)后,ALP染色、茜素紅染色和成骨相關(guān)基因檢測(cè)顯示,O-BMMSCs成骨分化能力明顯低于S-BMMSCs;成脂誘

10、導(dǎo)后,油紅O染色和成脂相關(guān)基因檢測(cè)顯示,O-BMMSCs成脂分化能力明顯高于S-BMMSCs。
　　(2)miRNA微陣列芯片統(tǒng)計(jì)分析,篩選出10條 miRNAs在 S-BMMSCs和O-BMMSCs中差異表達(dá),其中 miR-705、miR-3077-5p和 miR-20a差異最為明顯。qRT-PCR結(jié)果顯示miR-705的表達(dá)在O-BMMSCs中顯著升高,并在正常BMMSCs成骨分化過程中表達(dá)下降,在成脂分化過程中表達(dá)上升,同時(shí)

11、在骨組織內(nèi)表達(dá)豐度高于其他組織。因此選取miR-705進(jìn)行后續(xù)的功能研究。
　　(3)過表達(dá)miR-705和抑制miR-705后對(duì)BMMSCs的增殖能力無(wú)明顯影響。成骨誘導(dǎo)能力檢測(cè)顯示,上調(diào)miR-705的表達(dá)可顯著降低BMMSCs的成骨能力,而下調(diào)miR-705的表達(dá)可顯著增加BMMSCs的成骨能力;成脂分化能力檢測(cè)顯示,上調(diào)miR-705的表達(dá)可顯著增強(qiáng)BMMSCs的成脂分化,而下調(diào)miR-705的表達(dá)可顯著抑制BMMSCs的

12、成脂分化。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)Hoxa10和Foxo1為miR-705的候選靶基因,上調(diào)miR-705表達(dá)后引起二者蛋白表達(dá)下調(diào),下調(diào)miR-705后引起二者蛋白水平上調(diào),熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)進(jìn)一步證明 miR-705可以特異性與 Hoxa10、Foxo1 mRNA3′-非翻譯區(qū)結(jié)合。
　　(4)下調(diào)miR-705在O-BMMSCs中的表達(dá),能促進(jìn)Foxo1和Hoxa10及成骨分化關(guān)鍵基因的表達(dá),提高O-BMMSCs的成骨分化能力;同時(shí)

13、能降低成脂分化關(guān)鍵基因的表達(dá),降低O-BMMSCs的異常成脂分化,從而恢復(fù)O-BMMSCs的正常分化能力。
　　研究結(jié)論：
　　(1)雌激素缺乏所致OPM中,BMMSCs仍保持干細(xì)胞的基本特性和能力,但是成骨成脂分化平衡發(fā)生明顯偏移,成骨分化減低而更易于向成脂分化。
　　(2)雌激素缺乏所致OPM中,BMMSCs的miRNA表達(dá)出現(xiàn)差異,其中miR-705特異性上升。
　　(3) miR-705通過負(fù)向調(diào)控靶基因