大黃有效部位及偉素對慢性環(huán)孢素腎病大鼠的防治研究.pdf

1、環(huán)孢霉素A(cyclosporine A,CsA)是由真菌產(chǎn)生的環(huán)狀11肽活性物質(zhì)。自1983年FDA批準用于實體器官移植后,迅速成為器官移植抗排斥和自身免疫性疾病治療的一線藥物,臨床應用較多,療效確切。但該藥的副作用特別是慢性腎毒性限制了它的廣泛應用。由CsA腎毒性導致的慢性。腎功能進行性衰退的慢性環(huán)孢素腎病(chronic cyclosporine nephropathy,CCN)以漸進性腎功能不全、入球小動脈透明樣變性、炎癥細胞浸

2、潤、條索狀間質(zhì)纖維化和腎性免疫原性增加為主要特征性病理改變。Mihatsch等對腎移植患者的腎活檢資料進行分析,證實CsA所致腎小管中毒的發(fā)生率為9％～37％,急性。腎功能衰竭伴彌漫性間質(zhì)纖維化的發(fā)生率為0％～19％,條索狀間質(zhì)纖維化以及CsA相關(guān)動脈病變的發(fā)生率分別為5％～50％和5％～30％。研究認為,CCN的病因與腎小球缺血、腎內(nèi)腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-agiotensin system,RAS)激活、細胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

3、和自體吞噬、單核巨噬細胞(monocyte/macrophage,MC/MP)浸潤及炎癥、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-betor 1,TGF-β1)與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)/金屬蛋白酶抑制因子(tissueinhibitor of metalloproteinases,TIMPs)調(diào)節(jié)失衡、骨橋蛋白、核因子-kappa B(nuclear

4、 factor-kappa B,NF-κB)、Toll-樣受體等有關(guān)。針對其發(fā)病機制,人們進行了大量的臨床和實驗研究,并試圖應用西藥、中藥或采取減量甚至停用CsA的方式來防治CCN。
　　 大黃是我國傳統(tǒng)中藥之一,大黃有效部位(Rhubarb's effective parts,Pep)為大黃醇提液過大孔吸附樹脂得到的洗脫物,包含以下五種成分:大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸、蘆薈大黃素。文獻報道其在改善腦缺血、腦代謝及抗排斥

5、反應方面效果顯著。偉素(舒洛地特,sulodexide)是經(jīng)過高度純化的生物制品,與肝素同屬糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)類藥物。GAG通常指一大類分子,包括肝素、低分子肝素、硫酸類肝素、硫酸類皮膚素以及糖胺聚糖類化合物,它們具有共同的生物學活性即保護腎臟的活性。偉素由兩種GAG組成,在實驗模型中具有預防糖尿病腎病(dibetic nephropathy,DN)的活性,能夠抑制TGF-β1過度表達以及腎小球細

6、胞高濃度葡萄糖誘導的基質(zhì)合成,修復內(nèi)皮細胞機能障礙。但Rep和偉素是否可以通過改善腎臟缺血和代謝,對抗腎排斥反應及保護腎臟活性等機制影響CCN的發(fā)生和發(fā)展,目前尚未可知,亦無相關(guān)文獻報道。為此,我們復制了CCN大鼠模型,觀察不同劑量Rep和偉素在不同時間點對模型大鼠的干預和治療作用,并對其可能的作用機理進行探討。
　　 本論文分以下2部分。
　　 第1部分 Rep及偉素對CCN大鼠的干預作用
　　 目的:

7、　　 觀察Rep及偉素對CCN的預防效果。
　　 方法:
　　 1.實驗分組及生化指標測定:SPF級健康雄性Wistar大鼠54只(180～200g),給予低鹽飼料,自由飲水,適應性喂養(yǎng)1周后,將動物隨機分為9組,分別為:第一組正常對照組(VH3:橄欖油5ml·kg-1·d-1×28 d)；第二組模型組(MX3:CsA 25mg·kg-1·d-1×28 d)；第三組陽性對照組(YDY:CsA25mg·kg-1·d-1+

8、貝那普利5mg·kg-1·d-1×28 d)；第四組Rep干預1組(DY1:Rep 50mg·kg-1·d-1×7 d,后給予CsA 25mg·kg-1·d-1+Pep 50mg·kg-1·d-1×28 d,二藥灌胃時間間隔2h以上)；第五組Rep干預2組(DY2.CsA25mg·kg-1·d-1+Rep 50mg·kg-1·d-1×28 d,二藥灌胃時間間隔2h以上):第六組Rep干預3組(DY3:CsA 25mg·kg-1·d-1×

9、7 d,后給予CsA25mg·kg-1·d-1+Rep 50mg·kg-1·d-1×21 d,二藥灌胃時間間隔2h以上)；第七組偉素干預1組(WY1:偉素10mg·kg-1·d-1×7 d,后給予CsA 25mg·kg-1·d-1+偉素10mg·kg-1·d-1×28 d)；第八組偉素干預2組(WY2:CsA 25mg·kg-1·d-1+偉素10mg·kg-1·d-1×28 d)；第九組偉素干預3組(WY3:CsA 25mg·kg-1·

10、d-1×7 d,后給予CsA 25mg·kg-1·d-1+偉素10mg·kg-1·d-1×21 d)。按實驗設計,CsA及Rep為灌胃給藥,偉素為腹腔注射。所有大鼠均于第28天處死。實驗期間在用藥前和用藥后的每周最后一天測量大鼠體重并調(diào)整灌胃和腹腔注射劑量。同時采集大鼠尾靜脈血,測定血肌酐(serum creatinine,Scr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)。
　　 2.取腎組織行HE、PAS及

11、Masson染色觀察病理變化,分析各組小動脈透明樣變性、腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)情況并通過半定量積分評估其程度。入球小動脈透明樣變性通過計數(shù)入球及球旁小動脈病變來判斷。每個標本至少檢查50個小動脈,進行下列評分:0=無透明樣變性；1=早期透明樣變性；2=明顯透明樣變性。RIF通過計數(shù)每個視野損傷面積的百分比來評估:0=正常腎間質(zhì),0.5=<5％,1=5％到15％,1.5=16％到25

12、％,2=26％到35％,2.5=36％到45％,3=>45％腎間質(zhì)面積損傷。
　　 3.同時取腎組織行電鏡檢查觀察超微結(jié)構(gòu)變化。
　　 4.冰上分離腎臟并采取免疫組織化學法檢測腎組織CD68、Ⅲ型膠原及Ⅳ型膠原的表達,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測腎組織TGF-β1和TIMP-1 mRNA表達,ELISA法檢測TGF-β1、TIMP-1和MMP-9蛋白表達。
　　 結(jié)論:1.偉素和Rep單獨干預用藥均

13、可減輕CsA腎毒性,甚至可消除其部分毒性,早期干預效果更好。2.采用偉素或Rep預防CsA腎毒性優(yōu)于貝那普利。3.偉素在改善小動脈透明樣變性方面優(yōu)于Rep；改善RIF方面,提前給藥時偉素優(yōu)于Rep,而同時及后期給藥干預時效果相當,但干預機理不同。
　　 第2部分 Rep及偉素對CCN大鼠的治療作用
　　 目的:
　　 復制CCN模型,并于2周后停用CsA,觀察停用后腎毒性能否自行消除；同時觀察Rep及偉素對CCN

14、是否存在治療作用；并評估其療效。
　　 方法:
　　 1.實驗分組:SPF級健康雄性Wistar大鼠78只(180～200 g),給予低鹽飼料,自由飲水,適應性喂養(yǎng)1周后,將動物隨機分為9組分別為:第一組正常對照組(VH1:為對照1組,n=6,給予橄欖油5ml·kg-1·d-1×14 d,第14天處死；VH2:為對照2組,給予橄欖油5ml·kg-1·d-1×14 d,后改為注射用水5ml·kg-1·d-1×14 d,第2

15、8天處死；VH3:為對照3組,給予橄欖油5ml·kg-1·d-1×28 d,第28天處死)；第二組模型組(MX1:為模型1組,CsA25mg·kg-1·d-1×14 d,第14天處死；MX2:為模型2組,CsA 25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為注射用水5ml·kg-1·d-1×14 d,第28天處死；MX3:為模型3組,給予CsA25mg·kg-1·d-1×28 d,第28天處死)；第三組陽性對照組(YDZ:CsA25mg·

16、kg-1·d-1×14 d,后改為貝那普利5mg·kg-1·d-1×14 d)；第四組Rep治療1組(DZ1:CsA 25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為Rep 25mg·kg-1·d-1×14d)；第五組Rep治療2組(DZ2:CsA 25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為Rep50mg·kg-1·d-1×14 d)；第六組Rep治療3組(DZ3:CsA 25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為Rep 100mg·k

17、g-1·d-1×14 d)；第七組偉素治療1組(WZ1:CsA25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為偉素10mg·kg-1·d-1×14 d)；第八組偉素治療2組(WZ2:CsA 25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為偉素20mg·kg-1·d-1×14 d)；第九組偉素治療3組(WZ3:CsA 25mg·kg-1·d-1×14 d,后改為偉素40mg·kg-1·d-1×14 d)。按實驗設計CsA及Rep為灌胃給藥,偉素為