晚疫病菌誘導(dǎo)的兩個(gè)馬鈴薯泛素連接酶基因的克隆與功能分析.pdf

1、泛素-蛋白酶體通路在植物防衛(wèi)反應(yīng)(包括過敏性反應(yīng))中發(fā)揮重要作用,泛素連接酶(ubiquitin ligase,E3)則是參與這一過程的重要組分。本研究旨在通過克隆和分析與馬鈴薯晚疫病抗性相關(guān)的泛素連接酶家族中的成員,初步揭示這類基因在馬鈴薯晚疫病垂直抗性和水平抗性中的調(diào)控作用,或它們在馬鈴薯防御晚疫病菌侵染的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的作用,為進(jìn)一步深入開展抗性機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。
　　 本實(shí)驗(yàn)室從晚疫病誘導(dǎo)的馬鈴薯水平抗性材料構(gòu)建的cDN

2、A文庫中篩選出兩個(gè)與煙草Avr9/Cf-9 rapidly elicited protein(ACRE,具有泛素連接酶E3活性)基因有很高同源性的EST片段(10-A12和08-E12)。本研究中,我們克隆了這兩個(gè)EST片段所代表的基因,StRFP和StPUB,并研究了其生物學(xué)功能。
　　 StRFP基因的全長cDNA為1354 bp,包含一個(gè)789 bp的開放閱讀框(ORF),編碼262個(gè)氨基酸,含有高度保守的RING-H2型

3、RING指結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和GLD結(jié)構(gòu)域,是一個(gè)新的馬鈴薯ATL(Arabidopsis tóxico para levadura)蛋白。StRFP基因位于馬鈴薯第3條染色體上,不含內(nèi)含子。馬鈴薯基因組中可能有1～2個(gè)StRFP基因拷貝或與之同源性高的基因。利用洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行的StRFP-GFP融合蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示,StRFP在細(xì)胞膜上或膜外表達(dá)。RT-PCR分析結(jié)果表明,StRFP基因表達(dá)無組織特異性,在根、莖、葉、花、莖尖

4、、匍匐莖和塊莖等各種組織器官中組成型表達(dá),但不同部位的表達(dá)水平有差異。離體葉片的晚疫病原菌接種表明,StRFP在接種24 h后表達(dá)增強(qiáng),水楊酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、脫落酸(ABA)和機(jī)械傷害處理能誘導(dǎo)其表達(dá),乙烯(ETH)不能誘導(dǎo)其表達(dá)。試管苗在外界環(huán)境脅迫下的表達(dá)模式表明,StRFP對所研究的各種環(huán)境因素如NaCl、20％PEG、脫水、40℃熱激和4℃低溫都有響應(yīng),但對鹽脅迫和滲透脅迫的反應(yīng)更明顯。為了進(jìn)一步研究其功能,我

5、們分別構(gòu)建了CaMV35S驅(qū)動(dòng)下的StRFP基因正義表達(dá)載體和RNAi抑制表達(dá)載體,采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化鄂馬鈴薯3號(EP3)的試管薯,分別獲得超量表達(dá)株系27個(gè)和干涉株系6個(gè)。Southern雜交表明每個(gè)轉(zhuǎn)基因植株有1～3個(gè)拷貝。晚疫病病原菌接種實(shí)驗(yàn)表明,與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系更抗病,而抑制表達(dá)的株系更感病,說明StRFP基因?yàn)轳R鈴薯抗晚疫病反應(yīng)中的正向調(diào)控因子。
　　 StPUB基因全長2483 bp,

6、包含一個(gè)2175 bp的ORF,編碼724個(gè)氨基酸,GenBank登記號為EF091878。序列分析表明,StPUB蛋白具有保守的UND/U-box/ARM結(jié)構(gòu)域,與煙草ACRE276的氨基酸序列有89％的同源性。從馬鈴薯水平抗性材料(386209.10)、垂直抗性材料(鄂馬鈴薯3號,EP3)和感病材料(轉(zhuǎn)心烏,ZXW)中獲得StPUB基因的基因組DNA信息,序列分析表明該基因不含內(nèi)含子,且在三種不同抗性材料中大小一致,同源性達(dá)到97.

7、7％。通過TAIL-PCR與生物信息學(xué)分析,推測StPUB基因包含三個(gè)啟動(dòng)子序列,可能位于馬鈴薯第2條染色體上。Southern blot雜交結(jié)果表明,馬鈴薯基因組中可能有2～3個(gè)StPUB拷貝或與之同源性高的基因。離體葉片的誘導(dǎo)表達(dá)模式研究表明,晚疫病病原菌接種24 h后,StPUB表達(dá)明顯增強(qiáng),而且在三種不同的馬鈴薯抗性材料中表達(dá)趨勢一致；SA、ABA和機(jī)械傷害能激活StPUB表達(dá),而MeJA和ETH不能誘導(dǎo)其表達(dá)。試管苗在外界環(huán)境

8、脅迫下的RT-PCR結(jié)果顯示,熱激(40℃)、低溫(4℃)、20％PEG或NaCl能誘導(dǎo)StPUB表達(dá)。采用RNAi技術(shù),構(gòu)建了抑制StPUB基因表達(dá)的載體,并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入馬鈴薯垂直抗性品種EP3中,共獲得卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化植株13株。PCR檢測和Southern雜交結(jié)果表明,外源基因已經(jīng)整合到馬鈴薯基因組中,其拷貝數(shù)1～3個(gè)不等。對轉(zhuǎn)基因植株中StPUB基因的表達(dá)進(jìn)行RT-PCR分析表明,StPUB基因在轉(zhuǎn)基因植株中的

9、表達(dá)量比對照顯著降低,RNAi能有效的抑制StPUB基因的表達(dá)。從晚疫病病原菌離體接種結(jié)果發(fā)現(xiàn),沉默StPUB的轉(zhuǎn)基因株系,其病斑生長速率(LGR)比非轉(zhuǎn)基因?qū)φ崭?表明沉默StPUB基因降低了馬鈴薯的抗病性。轉(zhuǎn)基因株系試管苗耐鹽性試驗(yàn)結(jié)果表明,在鹽脅迫條件下,沉默StPUB的轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株相比,地上部分和根系生長相對較弱,根部腐爛的株數(shù)明顯增多,表明抑制StPUB表達(dá)降低了馬鈴薯轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性。上述結(jié)果表明,StPUB在激