原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元中滋補脾陰方藥抗Aβ神經(jīng)毒性的保護(hù)機制.pdf

1、目的： 阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙為主要特征的神經(jīng)退行性疾病?，F(xiàn)代研究的熱點認(rèn)為β-淀粉樣蛋白(amyloid-β-peptide，Aβ)的神經(jīng)毒性在AD發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。Aβ能引起進(jìn)行性突觸功能異常和神經(jīng)元丟失，最終導(dǎo)致AD中認(rèn)知功能障礙和行為異常。體內(nèi)外實驗研究Aβ能直接對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性，或增加神經(jīng)元對興奮毒的敏感性。突觸結(jié)構(gòu)的高度動力學(xué)可塑性及突觸傳遞中相應(yīng)的

2、結(jié)構(gòu)改變是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)，90％的興奮性突觸主要分布于樹突棘，樹突棘的發(fā)育和結(jié)構(gòu)變化受到調(diào)節(jié)突觸活化的分子機制的影響。突觸活化可誘導(dǎo)血清誘導(dǎo)激酶(serum-inducible kinase，SNK)靶向樹突棘相關(guān)的Rap-特異性GTPase-活化蛋白(spine-associated Rap guanosine triphosphataseactivating protein，SPAR)，通過泛素-蛋白酶體通路引起SPAR降解。SPA

3、R作為突觸后蛋白通過調(diào)節(jié)Rap信號和肌動蛋白骨架重塑來發(fā)揮調(diào)節(jié)樹突棘形態(tài)的作用。Rap活性和肌動蛋自動力學(xué)受到突觸活化調(diào)節(jié)而且與突觸可塑性有關(guān)，了解調(diào)節(jié)樹突棘肌動蛋白骨架的重塑必然有助于揭示奠定學(xué)習(xí)記憶基礎(chǔ)的突觸可塑性的分子機制。尚無研究報道在SNK-SPAR途徑中Aβ神經(jīng)毒性是如何發(fā)揮作用，進(jìn)而引起突觸可塑性改變。同樣，N-甲基-D-門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate Receptor，NMDAR)參與突觸發(fā)生、突

4、觸傳遞、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶等一系列進(jìn)程。Aβ的神經(jīng)毒性能引起谷氨酸細(xì)胞外堆積，NMDAR功能異常，鈣穩(wěn)態(tài)失衡。我們推測是否Ap神經(jīng)毒性、SNK-SPAR途徑、NMDAR三者之間存在聯(lián)系。 滋補脾陰方藥(Zibu Piyin Recipe，ZBPYR)以滋補脾陰為立方原則，針對脾陰虛證而設(shè)，含藥血清是根據(jù)血清藥理學(xué)方法獲得。既往臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn)ZBPYR有腦保護(hù)作用，含藥血清能明顯抗谷氨酸興奮毒，然而關(guān)于ZBPYR如何發(fā)揮神經(jīng)

5、保護(hù)作用調(diào)控突觸和樹突棘的分子機制我們還不十分清楚。 本課題的研究目的在于觀察Aβ與SNK-SPAR途徑、NMDAR之間的關(guān)系，探討ZBPYR抗Aβ神經(jīng)毒性保護(hù)神經(jīng)元的作用機制，為AD和其他神經(jīng)退行性疾病提供了新的研究思路和治療手段。 方法： 1．原代大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。 2．通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染將針對SNK的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)導(dǎo)入神經(jīng)元中，RT-PCR檢測S

6、NKmRNA沉寂情況以及SNK沉寂時SPARmRNA表達(dá)變化。 3．將干粉Aβ1-40配制成溶液，在37℃恒溫箱中孵育72h后獲得聚集態(tài)纖維狀A(yù)β1-40。 4．RT-PCR觀察神經(jīng)元暴露于5μM Aβ1-40，在刺激不同時間點SNK、SPARmRNA表達(dá)變化。 5．以血清藥理學(xué)方法獲得ZBPYR含藥血清；不同濃度的ZBPYR含藥血清預(yù)處理Aβ1-40刺激的神經(jīng)元，RT-PCR檢測神經(jīng)元中SNK、SPAR、NR1

7、、NR2A、NR2BmRNA表達(dá)變化。 結(jié)果： 1．siRNA轉(zhuǎn)染入神經(jīng)元后，與對照組和RNAi對照組相比，SNKmRNA表達(dá)下調(diào)，SPARmRNA表達(dá)上調(diào)，以SNK siRNA1效果最顯著。 2．在Aβ1-40刺激神經(jīng)元不同時間點中，與對照組相比，SNKmRNA表達(dá)呈上調(diào)趨勢，SPARmRNA表達(dá)呈下調(diào)趨勢，其中在Aβ1-40刺激2h時SNK、SPARmRNA表達(dá)變化達(dá)到高峰。 3．與對照組相比，Aβ1

8、-40刺激神經(jīng)元2h后，SNKmRNA表達(dá)上調(diào)，SPAR、NR1、NR2A、NR2BmRNA表達(dá)下調(diào)。 4．Aβ1-40組相比，ZBPYR含藥血清預(yù)處理組SNKmRNA表達(dá)下調(diào)，SPAR、NR1、NR2A、NR2BmRNA表達(dá)上調(diào)，以濃度2％ZBPYR含藥血清效果最顯著。 結(jié)論： 1．siRNA對SNKmRNA表達(dá)有抑制作用，相應(yīng)地SPARmRNA表達(dá)上調(diào)，表明SNK在SNK-SPAR途徑中起關(guān)鍵作用。