MEHP對原代培養(yǎng)新生大鼠下丘腦神經(jīng)元的毒性作用.pdf

1、目的：
　　下丘腦是人體內(nèi)的神經(jīng)-內(nèi)分泌高級調(diào)節(jié)中樞，在其發(fā)育的的關(guān)鍵時(shí)期，對內(nèi)、外源性激素作用非常敏感。鄰苯二甲酸單乙基己基酯(MEHP)是鄰苯二甲酸二乙基己基酯(DEHP)的活性代謝產(chǎn)物，具有抗雄激素作用和擬雌激素作用，對下丘腦神經(jīng)元的發(fā)育有可能產(chǎn)生干擾作用，但是相關(guān)研究少見報(bào)道。本研究通過體外試驗(yàn)探討MEHP對新生大鼠的下丘腦神經(jīng)元發(fā)育的干擾作用及其劑量反應(yīng)關(guān)系模型;并通過MEHP對下丘腦神經(jīng)元凋亡的影響，以及MEHP對雌激

2、素/雄激素介導(dǎo)的神經(jīng)元生長發(fā)育的影響，初步探討其作用的途徑及機(jī)制。
　　方法：
　　(1)新生大鼠下丘腦神經(jīng)元原代培養(yǎng)方法及神經(jīng)元鑒定:在原代培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元中，采用改良的機(jī)械吹打法制單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)液選用添加10％去類固醇血清的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h后將培養(yǎng)液更換為97％Neurobasal+2％B27+1％Glutamine培養(yǎng)液，以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的過度增殖。采用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定下

3、丘腦神經(jīng)元;采用H-E染色、Nissl染色法染色以觀察下丘腦神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。
　　(2)不同濃度MEHP（10-15mol/L-10-3mol/L）處理培養(yǎng)7d的下丘腦神經(jīng)元，作用24h、48h分別MTT法測定吸光度值并且計(jì)算細(xì)胞活力以及抑制率，建立MEHP對神經(jīng)元生長抑制作用的劑量-反應(yīng)關(guān)系模型;測量不同濃度MEHP對下丘腦神經(jīng)元神經(jīng)突長度、胞體面積以及突起個(gè)數(shù)的影響，觀察其對神經(jīng)元發(fā)育的影響。
　　(3)不同濃度ME

4、HP處理神經(jīng)元，Hoechst33258免疫細(xì)胞染色法分析神經(jīng)元凋亡情況并計(jì)算凋亡率;不同濃度E2/T處理神經(jīng)元，MTT法測定吸光度值并且計(jì)算細(xì)胞活力，確定適宜的E2/T濃度用于后續(xù)試驗(yàn);不同濃度MEHP與雌二醇(E2，10-7mol/L)或睪酮(T，10-7mol/L)聯(lián)合處理培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元，測量不同濃度MEHP與E2或T聯(lián)合處理組對下丘腦神經(jīng)元神經(jīng)突長度、胞體面積以及突起個(gè)數(shù)的影響，觀察其對神經(jīng)元發(fā)育的影響，并且，用Hoechs

5、t33258免疫細(xì)胞染色法分析不同濃度MEHP與E2或T聯(lián)合處理組對神經(jīng)元凋亡情況的影響并計(jì)算凋亡率。
　　結(jié)果：
　　(1)本研究原代培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元純度可達(dá)到95％以上，并且神經(jīng)元生長發(fā)育良好。(2)下丘腦神經(jīng)元在不同濃度MEHP中處理24h后，10-15mol/L、10-13mol/L、10-11mol/L、10-9mol/L、10-7mol/L、10-5mol/L、10-3mol/L折光性變差，胞體變小，神經(jīng)突變短

6、神經(jīng)元突觸之間的連接斷裂。10-15mol/L、10-3mol/L MEHP組抑制率分別為30.1％和33.6％，均對神經(jīng)元的生長具有明顯的抑制作用，而10-9mol/LMEHP組抑制率為1.6％，對神經(jīng)元的生長的抑制作用不明顯，MEHP不同處理組對下丘腦神經(jīng)元的抑制作用呈U型劑量-反應(yīng)關(guān)系曲線。(3)MEHP處理過的細(xì)胞，染色質(zhì)皺縮，呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，有凋亡小體出現(xiàn)。MEHP處理組與對照組比較凋亡率增加，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.

7、05），10-3mol/LMEHP組凋亡率最高，為83.98％。(4)不同濃度E2/T處理組對神經(jīng)元均具有促進(jìn)生長作用，經(jīng)過比較，本研究選取10-7mol/LE2/T作為后續(xù)試驗(yàn)的終濃度。(5)不同濃度MEHP與E2/T(10-7mol/L)聯(lián)合處理培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元，對下丘腦神經(jīng)元神經(jīng)突的長度以及胞體面積均有不同程度的減少。與E2/T組比較發(fā)現(xiàn)，MEHP拮抗E2/T介導(dǎo)的下丘腦神經(jīng)元的增殖作用。(6)10-7mol/L、10-5mol

8、/L、10-3mol/L MEHP+E2/T(10-7mol/L)處理組凋亡率分別為27.97％、42.8％、68.66％，與對照組比較，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MEHP拮抗E2/T介導(dǎo)的下丘腦神經(jīng)元的抗凋亡作用。
　　結(jié)論：
　　本研究結(jié)果表明，MEHP可抑制下丘腦神經(jīng)元的增殖，MEHP對下丘腦神經(jīng)元的影響存在非單調(diào)性的劑量-反應(yīng)關(guān)系。MEHP對下丘腦神經(jīng)元具有直接致凋亡作用，MEHP拮抗性激素E2/T介導(dǎo)的