轉(zhuǎn)染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復(fù)序列的BHK-21細(xì)胞沉默病毒復(fù)制研究.pdf

1、登革病毒(dengue rivus，DENV)屬于黃病毒科(Flavivirade)黃病毒屬(Flavivirus)，由其感染所引起的疾病包括:登革熱(dengue fever，DF)，登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合癥(dengue shocksyndrome，DSS)。嚴(yán)重的登革出血熱（登革出血熱和登革休克綜合癥），20世紀(jì)50年代在菲律賓和泰國(guó)登革熱流行期間被首次確認(rèn)[1]。截止

2、至2012年11月WHO報(bào)告，近幾十年來(lái)，世界各地的登革熱發(fā)病率大幅增長(zhǎng)。世界上二分之一的人口，非洲，美洲，東地中海，東南亞和西太平洋地區(qū)超過(guò)100個(gè)國(guó)家處于登革熱流行的威脅中，2008年，美洲、東南亞和西太平洋地區(qū)的國(guó)家登革熱病毒感染報(bào)告病例數(shù)120萬(wàn)，而到2010年，報(bào)告病例數(shù)上升至230萬(wàn)，最近報(bào)告病例仍在持續(xù)增加。登革熱不僅發(fā)病率和病死率呈上升趨勢(shì)，而且暴發(fā)疫情的地區(qū)也呈擴(kuò)大化的趨勢(shì)，以前從未發(fā)現(xiàn)過(guò)登革熱疫情的國(guó)家遭受登革病毒的

3、威脅[3,4]。登革熱在2012年被WHO列為傳播速度最快的媒介傳播病毒性疾病，它具有在世界上出現(xiàn)流行的可能性。全世界需要改變應(yīng)對(duì)方式，并實(shí)施可持續(xù)性預(yù)防措施。登革熱成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。
　　 目前控制登革熱的方法主要是用化學(xué)方法控制傳播媒介，這種方法對(duì)登革病毒的預(yù)防和控制發(fā)揮了舉足輕重的作用。然而，隨著殺蟲(chóng)劑等化學(xué)制劑的廣泛應(yīng)用，這種方法亦產(chǎn)生許多的負(fù)面影響:蚊蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥基因，破壞環(huán)境—化學(xué)制劑殘留于環(huán)境中。同時(shí)，由于熱帶和亞

4、熱帶地區(qū)城市化進(jìn)程加快以及國(guó)際間交流的增加導(dǎo)致白紋伊蚊活動(dòng)范圍擴(kuò)大[5-7]，登革病毒的疫區(qū)產(chǎn)生擴(kuò)大化趨勢(shì)。因而，有學(xué)者指出，應(yīng)對(duì)登革病毒傳播需要有效的新策略。如加緊致力于新型有效疫苗的研發(fā)，通過(guò)基因修飾或操縱傳播媒介等。通過(guò)基因修飾傳播媒介，改變病毒感染的宿主易感性，從而達(dá)到媒介中病毒復(fù)制的降低或消除，這種方法稱(chēng)為源于病原體的抵抗(pathogen-derived resistance，DPR)[8-9]。DPR最早在植物中發(fā)現(xiàn)，合成

5、的煙草花葉病毒外殼蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)有效地保護(hù)了植物來(lái)自同源病毒的攻擊。這種現(xiàn)象后來(lái)被命名為RNA干擾效應(yīng)。RNA干擾是指一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，RNAi被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于生物界，從低等原核生物、真菌、無(wú)脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了此種現(xiàn)象。RNAi抗病毒的效應(yīng)已在多種媒介昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，Ronald P.van Rij[10]等發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅中RNAi途徑中關(guān)鍵酶Ago-2缺陷株體內(nèi)病毒RNA呈高水平累積;Va

6、rgas[11]等通過(guò)敲除RNAi途徑中的AGO-2、Dcr-2和R2D2的表達(dá)后，能增加登革Ⅱ型病毒在埃及伊蚊體內(nèi)的復(fù)制。有研究者已開(kāi)始利用RNAi干擾的技術(shù)修飾或改造媒介，使得媒介減少攜帶或者不攜帶病毒。Anthony KG等[12-14]通過(guò)引入dsRNA已成功用于抑制西尼羅河病毒(WNV)、日本腦炎病毒（JEV）和黃熱病毒(YFV)的復(fù)制;Franz AW等[15-16]經(jīng)短片段RNA(short interfering RNA

7、，siRNA)改造的轉(zhuǎn)基因蚊有效地阻止病毒的感染和傳播;Zhang等[17]通過(guò)腺病毒載體轉(zhuǎn)染短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，對(duì)DENV-2復(fù)制產(chǎn)生干擾效應(yīng)，抑制病毒的復(fù)制。RNAi有望成防控登革病毒感染的新策略。
　　 登革病毒的基因組為單股正鏈RNA分子，約含11000個(gè)堿基，具有單一的可讀框，編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白和七種非結(jié)構(gòu)蛋白，其編碼基因順序?yàn)?5'-C-prM-E-NS1-N

8、S2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3'。其中prM蛋白的切割被認(rèn)為是未成熟病毒顆粒向成熟病毒顆粒轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟，與病毒的裝配、成熟和維持病毒的感染性有關(guān)[18-19]。因而，prM被許多研究者選為觸發(fā)RNAi的效應(yīng)基因。成功介導(dǎo)RNAi還需穩(wěn)定高效的表達(dá)系統(tǒng)。質(zhì)粒作為載體導(dǎo)入效應(yīng)基因有以下優(yōu)點(diǎn):可以使用不同的選擇性標(biāo)志;通過(guò)構(gòu)建可誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)，可長(zhǎng)期穩(wěn)定進(jìn)行基因表達(dá);進(jìn)行大規(guī)模基因篩選的成本低[20]。本研究利用能

9、在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)的真核表達(dá)載pcDNA3.1(+)，把登革Ⅱ型病毒前膜蛋白反向重復(fù)序列克隆到該表達(dá)載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至登革病毒易感性高的BHK-21中初步探討干擾病毒復(fù)制的效果，半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析評(píng)價(jià)其抑制病毒復(fù)制的效果，為防控登革病毒感染的新策略提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　 目的:
　　 1.構(gòu)建RNAi表達(dá)載體:將登革Ⅱ型病毒前膜蛋白反向重復(fù)序列克隆至能在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高效表達(dá)的真核表達(dá)載

10、體pcDNA3.1(+)中。
　　 2.構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP，轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，測(cè)定轉(zhuǎn)染效率。
　　 3.轉(zhuǎn)染登革Ⅱ型病毒前膜蛋白基因反向重復(fù)序列至BHK-21細(xì)胞，半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR評(píng)價(jià)重組質(zhì)粒抑制病毒復(fù)制的效果。
　　 方法:
　　 1.乳鼠內(nèi)接種登革Ⅱ型病毒，提取病毒total RNA。
　　 2.正義和反義引物兩端分別加上XhoⅠ和EcoRⅠ的識(shí)別位點(diǎn)，以提取

11、的totalRNA為模板，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增的prM全長(zhǎng)基因片段插入pcDNA3.1(+)中，形成含有prM反向序列的重組質(zhì)粒pcDNA-asprM。
　　 3.于另一對(duì)正義和反義引物兩端引入酶切位點(diǎn)NheⅠ和BglⅡ，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增prM全長(zhǎng)基因片段插入pMD18-T-vector中，形成含有正向序列的重組質(zhì)粒pMD18-T-prM。
　　 4.限制性?xún)?nèi)切酶NheⅠ和KpnⅠ分別酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-prM和

12、重組質(zhì)粒pcDNA-asprM，得到片段prM和線性化載體pcDNA-asprM，連接構(gòu)建成含有prM反向重復(fù)序列的重組質(zhì)粒pcDNA-irRNA。
　　 5.擴(kuò)增增強(qiáng)型熒光蛋白基因片段(eGFP)，克隆至pcDNA3.1(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP。
　　 6.重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染效率。
　　 7.BHK-21細(xì)胞繁殖登革Ⅱ型病毒，收集病毒液。
　　 8

13、.免疫熒光檢測(cè)登革病毒感染BHK-21細(xì)胞。
　　 9.TCID50方法測(cè)定收集的病毒液滴度。
　　 10.篩選的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pcDNA-irRNA和空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至BHK-21細(xì)胞中。
　　 11.登革Ⅱ型病毒攻擊細(xì)胞，染毒后不同時(shí)間收集細(xì)胞total RNA。
　　 12.半定量PCR檢測(cè)NS3基因的表達(dá)，以評(píng)估病毒復(fù)制水平。
　　 13.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞

14、內(nèi)病毒載量，評(píng)估細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制水平。
　　 14.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NS1基因表達(dá)，評(píng)估病毒復(fù)制水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.收集接種登革Ⅱ型病毒乳鼠鼠腦病毒液并提取病毒RNA。
　　 2.RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增前膜蛋白全長(zhǎng)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)單一條帶，擴(kuò)增效果較好，其大小約600bp，與理論值基本相符，測(cè)序結(jié)果提交至NCBI進(jìn)行比對(duì)，同源性達(dá)97％。
　　 3.構(gòu)建的重組

15、載體pMD18-T-prM，pcDNA-asprM和含有prM反向重復(fù)序列的重組質(zhì)粒pcDNA-irRNA，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切均可見(jiàn)特異的酶切條帶。
　　 4.成功擴(kuò)增增強(qiáng)型熒光蛋白基因eGFP序列，經(jīng)測(cè)序證實(shí)重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP中的eGFP cDNA序列與質(zhì)粒pEGFP-N質(zhì)粒(Gene blank accession:#U55762)中的EGFP cDNA序列一致，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP。

16、　　 5.成功在本室建立登革Ⅱ型病毒感染BHK-21細(xì)胞模型，收集病毒液經(jīng)TCID50測(cè)得的滴度為106.48TCID50/0.1 ml。
　　 6.重組質(zhì)粒pcDNA-eGFP轉(zhuǎn)染BHK-21后，在細(xì)胞內(nèi)有增強(qiáng)型熒光蛋白表達(dá)，并初步測(cè)定轉(zhuǎn)染率:在24h、48h、72h和96h轉(zhuǎn)染率分別為36.3％、45.0％、31.6％和31.3％。
　　 7.在不同時(shí)間點(diǎn)收集經(jīng)DENV-2攻擊的實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞中

17、的RNA，半定量PCR檢測(cè)NS3mRNA的表達(dá)。擴(kuò)增的NS3基因電泳帶存在明顯差異。Glyko BandScan分析NS3和內(nèi)參GAPDH灰度的比值，結(jié)果顯示，48hpi和60hpi，實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組的NS3mRNA表達(dá)量基本相同，在96hpi，實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組間mRNA表達(dá)量存在差異，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的NS3表達(dá)水平比陽(yáng)性對(duì)照組降低28％。
　　 8.建立熒光定量PCR檢測(cè)DENV2的方法:擴(kuò)增NS1基因和內(nèi)參GAP

18、DH，陽(yáng)性擴(kuò)增曲線整體平行性好，基線平坦，曲線光滑，拐點(diǎn)清楚，呈S形，重復(fù)性好;收集的溶解曲線峰型單一，只有一個(gè)主峰。表明所采用的反應(yīng)體系和引物的擴(kuò)增效率、特異性和模板的量都是合適的;利用登革Ⅱ型病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因，構(gòu)建了檢測(cè)登革Ⅱ型病毒的標(biāo)準(zhǔn)品，在標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上，可以檢測(cè)出待測(cè)標(biāo)本中病毒的拷貝數(shù)。
　　 9.在不同時(shí)間點(diǎn)收集經(jīng)DENV-2攻擊的實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組BHK-21細(xì)胞中的RNA，應(yīng)用FQ-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)病

19、毒載量的變化。結(jié)果顯示，在48hpi內(nèi)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)病毒載量變化不大，在72hpi，兩組細(xì)胞內(nèi)病毒載量達(dá)到峰值，但實(shí)驗(yàn)組病毒量與對(duì)照組相比，病毒拷貝數(shù)少1.44倍。在96hpi，實(shí)驗(yàn)組病毒載量比陽(yáng)性對(duì)照組病毒載量降低26.7％。
　　 10.在不同時(shí)間點(diǎn)收集經(jīng)DENV-2攻擊的實(shí)驗(yàn)組和陽(yáng)性對(duì)照組BHK-21細(xì)胞中的RNA，應(yīng)用FQ-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NS1表達(dá)水平的差異。歸一化值結(jié)果顯示病毒感染96h后，實(shí)驗(yàn)組中NS1表達(dá)