幽門螺桿菌23SrRNA外克拉霉素耐藥基因分析.pdf

1、本文運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)、抗生素選擇壓力、轉(zhuǎn)座子插入失活、E-test檢測(cè)等方法分析不同CLR濃度下篩選的耐藥HP菌株的發(fā)生機(jī)制，以期進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的CLR耐藥相關(guān)基因。 首先，以HP 26695為出發(fā)菌株，采用連續(xù)傳代法，在含CLR平皿上選擇耐藥突變體，提取全菌蛋白后通過(guò)雙向凝膠電泳(2-DE)分離蛋白，銀染后應(yīng)用2D-ImageMaster。軟件比較不同濃度CLR耐藥菌株和敏感菌株的蛋白表達(dá)差異，對(duì)部分表達(dá)差異的蛋白點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶

2、解，通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行鑒定，并在NCBI的HP蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索理論上酶解肽段能與之相匹配的蛋白。結(jié)果顯示，共10個(gè)蛋白點(diǎn)在耐藥菌株與野生菌株以及不同濃度的耐藥菌株之間有明顯差異，其中3個(gè)蛋白點(diǎn)為DNA指導(dǎo)的RNA多聚酶α亞單位，其表達(dá)量和等電點(diǎn)在耐藥菌株與野生株之間存在明顯差異；1個(gè)蛋白點(diǎn)為黃素氧化還原蛋白，其在耐藥株中表達(dá)量上調(diào)；2個(gè)蛋白點(diǎn)為30S核糖體蛋白S1，其在耐藥株中表達(dá)量下調(diào)

3、：3個(gè)蛋白點(diǎn)為過(guò)氧化氫酶，其在耐藥株中表達(dá)量上調(diào)。以上9個(gè)蛋白點(diǎn)只在耐藥株與野生株間存在差異，不同濃度耐藥菌株之間變化趨勢(shì)一致。然而細(xì)胞分裂抑制劑在不同濃度藥株間表達(dá)量卻不相同，具體為低濃度CLR耐藥株較野生株表達(dá)量上調(diào)，而高濃度耐CLR菌株較野生株表達(dá)量下調(diào)，說(shuō)明不同濃度耐藥株的耐藥機(jī)制有不同的相關(guān)靶點(diǎn)。這對(duì)于研究HP23S rRNA外CLR的耐藥機(jī)制提供了線索。在蛋白表達(dá)水平尋找到部分差異的同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用帶有氯霉素標(biāo)簽可以隨機(jī)在染

4、色體上插入的轉(zhuǎn)座子(TN5)作為研究的主要工具，成功建立了一個(gè)全基因組隨機(jī)插入失活的HP突變體庫(kù)，尋找到新的CLR耐藥相關(guān)基因—HP1469。該基因編碼外膜蛋白Omp31，后者屬于Hop家族，是一種膜孔蛋白，與物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。 為驗(yàn)證23S rRNA、HPl469與臨床CLR敏感及耐藥菌株的關(guān)系，采用隨機(jī)對(duì)照研究方法對(duì)兩種常用含克拉霉素的HP根除治療方案的療效進(jìn)行對(duì)比，得出結(jié)論：①建議以PPI聯(lián)合克拉霉素、阿莫西林為根除HP

5、的一線治療方案；②HP對(duì)CLR原發(fā)耐藥率20.5％，繼發(fā)耐藥率36.4％。爾后通過(guò)測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)：①實(shí)驗(yàn)室壓力選擇耐藥株無(wú)23S rRNA 2115，2141，2142，2143點(diǎn)突變；臨床分離耐藥株也無(wú)以上4點(diǎn)的點(diǎn)突變；原發(fā)耐藥株存在2147A/G，2186T/C，2244G/A SNP，繼發(fā)耐藥株存在2186T/C SNP：②原發(fā)CLR耐藥菌株和繼發(fā)CLR耐藥菌株的OMP31氨基酸序列同源性較CLR敏感菌株低，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CLR

6、敏感菌株與原發(fā)CLR耐藥菌株及繼發(fā)CLR耐藥菌株兩兩比較，無(wú)顯著差異。氨基酸差異分析表明，耐藥菌株主要表現(xiàn)在第100位氨基酸門冬氨酸、第113位氨基酸天冬酰胺、第173位氨基酸組氨酸的替換。 同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)直接取<'14>C-UBT及RUT同時(shí)陽(yáng)性患者的胃黏膜組織，提取DNA后以HP的基因序列(如23SrRNA)鑒定，PCR方法擴(kuò)增出目的片段HP1469,測(cè)序結(jié)果顯示，胃粘膜來(lái)源及菌株來(lái)源的OMP31氨基酸序列與標(biāo)準(zhǔn)的OMP31氨