幽門(mén)螺桿菌對(duì)克拉霉素耐藥性及其機(jī)理的研究.pdf

1、背景與目的人類(lèi)幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori，簡(jiǎn)稱(chēng)H.pylori或簡(jiǎn)寫(xiě)為Hp)是一種革蘭氏陰性菌，主要存在于胃粘膜的粘液層，被認(rèn)為是慢性活動(dòng)性胃炎、萎縮性胃炎、十二指腸球部潰瘍的重要致病因素，是胃癌的高危因素，與粘膜相關(guān)的淋巴瘤等疾病關(guān)系密切。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)H.pylori感染和許多胃腸外疾病，包括心血管疾病、皮膚病等有某種統(tǒng)計(jì)學(xué)上的關(guān)聯(lián)，因此，H.pylori感染及其相關(guān)疾病已成為重要的公共健康課題。

2、H.pylori對(duì)抗生素，特別是對(duì)克拉霉素和甲硝唑的原發(fā)耐藥率在普遍上升.對(duì)常用根除方案的療效產(chǎn)生了影響。闡明耐藥機(jī)制、克服原發(fā)耐藥、避免繼發(fā)耐藥和治療失敗后的補(bǔ)救治療是近年H.pylori治療方面的研究熱點(diǎn)。 關(guān)于克拉霉素耐藥機(jī)制，1996年Versalovic等首次報(bào)道了克拉霉素耐藥性的產(chǎn)生與H.pylori23SrRNA基因的點(diǎn)突變有關(guān)，導(dǎo)致核糖體的構(gòu)象改變，使大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素結(jié)合位點(diǎn)也隨之發(fā)生改變，進(jìn)而使H.pylori

3、與大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥親和能力減弱，藥物不能阻止細(xì)菌的蛋白合成，最終產(chǎn)生耐藥性。 基因芯片其實(shí)質(zhì)是在玻片、硅片、薄膜等載體上有序地、高密度地固定大量的靶基因片段或寡核苷酸片段，這些被固定的分子探針在基質(zhì)上就形成了高密度的DNA微陣列。樣品核酸分子經(jīng)過(guò)標(biāo)記后，與固定在載體上的DNA陣列中的點(diǎn)進(jìn)行雜交。通過(guò)檢測(cè)雜交信號(hào)而獲得樣品分子的數(shù)量和序列信息，從而對(duì)基因序列及功能進(jìn)行大規(guī)模、高密度的研究。由于基因芯片采用了信息的集約化和平行處理原理，

4、具有無(wú)可比擬的高效、快速和多參數(shù)的特點(diǎn)，是傳統(tǒng)生物技術(shù)的一次重大創(chuàng)新和突破?；蛐酒瑧?yīng)用面很廣，如醫(yī)學(xué)、軍事、司法及農(nóng)業(yè)等，具體包括基因表達(dá)譜、疾病診斷、藥物篩選、新基因?qū)ふ摇⒅販y(cè)序、基因分型、遺傳作圖和基因突變等多個(gè)領(lǐng)域。還可以進(jìn)行基因功能研究及疾病發(fā)生機(jī)制、疾病分型及藥物篩選等多方面研究。 本研究選取胃鏡下胃黏膜活檢標(biāo)本，體外分離、培養(yǎng)幽門(mén)螺桿菌，并行克拉霉素藥敏試驗(yàn)，初步篩查人群中幽門(mén)螺桿菌對(duì)克拉霉素的耐藥情況。寡核苷酸微

5、陣列技術(shù)與測(cè)序檢測(cè)H.pylori23SrRNA基因2142、2143和2182位點(diǎn)突變，分析H.pylori23SrRNA基因多態(tài)性與H.pylori對(duì)克拉霉素耐藥的關(guān)系，探索H.pylori對(duì)克拉霉素耐藥的分子機(jī)制，指導(dǎo)臨床用藥。 第一部分人群中幽門(mén)螺桿菌對(duì)克拉霉素耐藥性的調(diào)查本實(shí)驗(yàn)收集胃鏡檢查病例，取胃黏膜活檢標(biāo)本進(jìn)行H.pylori培養(yǎng)，分離鑒定后行克拉霉素藥敏試驗(yàn)，初步篩查H.pylori對(duì)克拉霉素的耐藥情況，監(jiān)測(cè)H.

6、pylori耐藥菌株。 1、材料胃粘膜活檢標(biāo)本取自普陀人民醫(yī)院、三門(mén)人民醫(yī)院、義烏市人民醫(yī)院、鎮(zhèn)海龍賽醫(yī)院，嘉興市第一人民醫(yī)院、溫嶺市第一人民醫(yī)院行胃鏡檢查的病人，胃竇和胃體各取1塊粘膜組織?；颊呓邮芪刚衬せ顧z均簽署知情同意書(shū)。 2、實(shí)驗(yàn)方法胃鏡下活檢組織研磨后加入增菌管中，37℃微需氧培養(yǎng)48小時(shí)，再用接種環(huán)挑取增菌液在分離培養(yǎng)基上分離，微需氧培養(yǎng)72小時(shí)，進(jìn)行純培養(yǎng)。所得菌株直接顯微鏡檢查后經(jīng)氧化酶反應(yīng)試驗(yàn)法、觸酶試

7、驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)鑒定為H.pylori菌株。最后用紙片瓊脂擴(kuò)散法行抗生素藥物敏感試驗(yàn)檢測(cè)H.pylori對(duì)克拉霉素的耐藥性。 3、結(jié)果(1)H.pylori菌落形態(tài)：圓形孤立的小菌落，灰白色、半透明呈露滴狀，直徑約0.5～1.5mm，血瓊脂上有輕度溶血。顯微鏡下可見(jiàn)菌體細(xì)長(zhǎng)彎曲呈螺形、S形或海鷗形，革蘭氏染色陰性。經(jīng)生化試驗(yàn)鑒定為H.pylori菌株。 (2)在1439病例中培養(yǎng)陽(yáng)性率為32.73％。(3)H.pylori

8、培養(yǎng)陽(yáng)性菌株471株，其中藥敏試驗(yàn)顯示對(duì)克拉霉素耐藥有165株，耐藥率為35.03％。H.pylori對(duì)克拉霉素耐藥率無(wú)年齡和性別的差異。 第二部分對(duì)克拉霉素耐藥幽門(mén)螺桿菌23SrRNA基因多態(tài)性的研究本實(shí)驗(yàn)試圖利用基因芯片技術(shù)來(lái)檢測(cè)H.pylori23SrRNA基因的多態(tài)性，探索H.pylori對(duì)克拉霉素耐藥的分子機(jī)制，明確H.pylori23SrRNA基因多態(tài)性與H.pylori對(duì)克拉霉素耐藥的關(guān)系，發(fā)展個(gè)性化給藥方案，為初

9、步建立技術(shù)檢測(cè)平臺(tái)提供基礎(chǔ)。 1、材料胃粘膜活檢標(biāo)本取自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院消化科行胃鏡檢查的病人。 2、實(shí)驗(yàn)方法胃鏡活檢標(biāo)本抽提DNA后，利用H.pylori23SrRNA行PCR基因片段擴(kuò)增，參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，用芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)至醛基化玻片上，Cy3-標(biāo)記的不對(duì)稱(chēng)PCR產(chǎn)物與之雜交，雜交完成后芯片用激光共聚焦掃描儀掃描并分析。采用CEQTMTDCS試劑盒(BECKMANCOULTERTM，USA)，在CEQ

10、TM2000XL測(cè)序儀(BECKMANCOULTERTM，USA)上進(jìn)行測(cè)序。 3、結(jié)果經(jīng)病理和PCR證實(shí)為H.pylori陽(yáng)性的54例標(biāo)本，雜交結(jié)果顯示A2142位點(diǎn)均為野生型(54/54)；A2143G突變率為11.11％(6/54)，尚未發(fā)現(xiàn)A2143C和A2143T的突變；C2182T突變率為12.96％(7/54)，尚未發(fā)現(xiàn)C2182A和C2182G的突變，其余均為野生型。 直接測(cè)序法驗(yàn)證：寡核苷酸微陣列技術(shù)與

11、測(cè)序檢測(cè)H.pylori23SrRNA基因多態(tài)性結(jié)果完全一致。 結(jié)論1、H.pylori對(duì)克拉霉素耐藥率為35.03％。2、H.pylori23SrRNAA2142位點(diǎn)均為野生型(54/54)；A2143G突變率為11.11％(6/54)，尚未發(fā)現(xiàn)A2143C和A2143T的突變；C2182T突變率為12.96％(7/54)，尚未發(fā)現(xiàn)C2182A和C2182G的突變，其余均為野生型。 3、直接測(cè)序法驗(yàn)證寡核苷酸微陣列技術(shù)