流產(chǎn)布魯菌pyk和ppdk基因缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性分析.pdf

1、布魯菌是一種人畜共患病原菌，兼性胞內(nèi)寄生，革蘭氏染色呈陰性，感染后主要導(dǎo)致人的波狀熱和動(dòng)物的流產(chǎn)。布魯菌缺少典型的毒力因子，如細(xì)胞溶素、外毒素、莢膜等，其致病性主要表現(xiàn)為入侵靶細(xì)胞并在胞內(nèi)長(zhǎng)期存活的能力。近年來(lái)，胞內(nèi)菌的碳代謝與細(xì)菌毒力之間的關(guān)系成為研究的熱點(diǎn)，李斯特桿菌、志賀氏菌、結(jié)核桿菌等胞內(nèi)菌能夠通過(guò)調(diào)控自身代謝來(lái)適應(yīng)胞內(nèi)惡劣的生存環(huán)境，如低pH，營(yíng)養(yǎng)匱乏、氧化應(yīng)激等，而目前對(duì)布魯菌碳代謝與毒力的關(guān)系知之甚少。
　　本實(shí)驗(yàn)室

2、前期利用信號(hào)標(biāo)簽隨機(jī)突變(STM)技術(shù)篩選到了兩個(gè)與布魯菌毒力相關(guān)的碳代謝基因，即丙酮酸激酶基因(pyk，locus tag BAB_RS24320)和丙酮酸磷酸雙激酶基因(ppdk，locus tag BAB_RS18420)。為了進(jìn)一步研究pyk和ppdk基因功能，本研究利用同源重組方法構(gòu)建了pyk和ppdk定向缺失株，通過(guò)比較基因缺失后布魯菌的生物學(xué)特性變化來(lái)研究基因的功能，其中對(duì)pyk缺失株的研究更加深入。
　　當(dāng)pyk基

3、因缺失后，生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示布魯菌生長(zhǎng)速度減慢，尤其在營(yíng)養(yǎng)條件匱乏的條件下，減慢的趨勢(shì)更加顯著；耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Δpyk缺失株對(duì)氧化劑的耐受能力降低，然而對(duì)低pH、大牛血清、多粘菌素B的耐受能力與野毒相當(dāng)；胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Δpyk在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力降低，并利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了Δpyk在巨噬細(xì)胞內(nèi)減弱排斥溶酶體降解的能力；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Δpyk缺失株不能在小鼠體內(nèi)建立慢性感染，這與Δpyk缺失株胞內(nèi)存活能力減弱是密切相關(guān)

4、的，表明pyk基因確實(shí)與布魯菌的毒力密切相關(guān)。當(dāng)ppdk缺失后，生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示布魯菌生長(zhǎng)速度減慢；耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Δppdk對(duì)多粘菌素B和大牛血清的耐受能力降低，然而對(duì)雙氧水耐受能力同野毒相當(dāng)；胞內(nèi)存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力降低，同動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中Δppdk對(duì)小鼠的致病力減弱的結(jié)果相符，表明ppdk基因也與布魯菌毒力密切相關(guān)。
　　綜上，本研究通過(guò)構(gòu)建布魯菌碳代謝相關(guān)的Δpyk和Δppdk定向突變株，并測(cè)定缺失株主要的生物