氯化鋰聯(lián)合臍血干細(xì)胞及脊髓去細(xì)胞支架移植修復(fù)大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脊髓損傷(spinal cord injuries,SCI)是現(xiàn)在交通、工礦事故、運(yùn)動(dòng)意外以及戰(zhàn)傷中常見(jiàn)的損傷,傷者多為青壯年,損傷造成的截癱不僅嚴(yán)重影響患者的身心健康,而且給家庭和社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)、人力和精神負(fù)擔(dān)。長(zhǎng)期以來(lái)脊髓損傷的修復(fù)一直是困擾人類健康的難題,也是世界各國(guó)科學(xué)家們致力于研究的焦點(diǎn),但目前缺少切實(shí)可行的有效治療方法。脊髓損傷的治療一直是神經(jīng)科學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn),傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,由于神經(jīng)元自身再生能力差

2、和外在微環(huán)境的抑制,損傷神經(jīng)是不可再生的。1981年神經(jīng)學(xué)家在基礎(chǔ)研究中證實(shí)中樞神經(jīng)損傷后的神經(jīng)結(jié)構(gòu)修復(fù)是可能的,掀起了各國(guó)學(xué)者對(duì)脊髓修復(fù)研究的又一次熱潮。SCI后軸突再生障礙的因?yàn)橄喈?dāng)復(fù)雜,其主要因?yàn)橛?(1)對(duì)脊髓的直接損傷及繼發(fā)炎癥使脊髓內(nèi)功能神經(jīng)元大量壞死或凋亡且神經(jīng)元再生困難；(2)脊髓損傷后暴露的髓鞘相關(guān)抑制分子、軸突生長(zhǎng)抑制性蛋白的大量分泌和釋放及繼發(fā)形成的膠質(zhì)瘢痕阻礙了軸突的生長(zhǎng)和正確連接；(3)損傷造成局部細(xì)胞凋亡,致

3、使細(xì)胞分泌的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子減少,破壞了神經(jīng)元修復(fù)和支持軸突再生的有利微環(huán)境。目前SCI的修復(fù)研究主要集中在以下幾個(gè)方面:(1)藥物治療:如傳統(tǒng)的大劑量皮質(zhì)類固醇激素(甲基強(qiáng)的松龍)的沖擊治療,可以有效的減輕脊髓的繼發(fā)性炎癥損傷,保護(hù)并防止殘存的損傷神經(jīng)元進(jìn)一步凋亡。目前研究的氯化鋰(LiCl)、免疫抑制劑FKS06等除了可以保護(hù)損傷神經(jīng)元外,還可以有效的促進(jìn)損傷軸突再生。(2)細(xì)胞移植:細(xì)胞移植是目前研究的熱點(diǎn),其原理是利用某些種子細(xì)胞可

4、以分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、黏附和趨化因子,營(yíng)養(yǎng)并保護(hù)損傷神經(jīng)元、誘導(dǎo)軸突再生及再髓鞘化來(lái)修復(fù)SCI。既往的研究已為SCI修復(fù)提供了較成熟的種子細(xì)胞,如:胚胎干細(xì)胞(ESCs)、雪旺氏細(xì)胞(SCs)、嗅鞘細(xì)胞(OECs)、神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、臍血干細(xì)胞(UCBCs)等,大量研究證實(shí)細(xì)胞移植均能夠在一定程度上促進(jìn)脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)。(3)組織移植:隨著組織工程學(xué)的飛速發(fā)展,一種更先進(jìn)的SCI修復(fù)理念逐步形成,即

5、修復(fù)SCI必須包括組織水平上的重建,整合SCI治療研究的各種有效策略,在誘導(dǎo)軸突定向再生的同時(shí),減少局部膠質(zhì)瘢痕形成。目前,應(yīng)用于脊髓的組織工程支架主要有兩種,一種為人工合成可降解高分子生物材料,如:聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等,另一種為自體或異體組織移植,如異體胚胎脊髓組織、自體肌纖維支架、游離周圍神經(jīng)或帶血管蒂的游離周圍神經(jīng)組織移植修復(fù)脊髓損傷,也取得了一定的修復(fù)效果。(4)改善脊髓損傷局部微環(huán)境:SCI后軸突再生困難的另一關(guān)鍵因素

6、就是適宜軸突再生的微環(huán)境遭到破壞,各種不利于軸突再生的髓磷脂源性蛋白(myelin,MAG,Nogo-A,Omgp)軸突再生抑制分子大量分泌,而各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF、GDNF、NGF、NT3等)的缺乏及膠質(zhì)瘢痕形成阻礙了軸突再生。(5)聯(lián)合治療:采取聯(lián)合不同作用機(jī)制的治療方法,更好的發(fā)揮協(xié)同作用來(lái)促進(jìn)SCI后神經(jīng)修復(fù)。本研究擬用氯化鋰聯(lián)合臍血干細(xì)胞及脊髓去細(xì)胞支架移植修復(fù)大鼠脊髓全橫斷損傷,觀察該方法對(duì)SCI后神經(jīng)再生和脊髓修復(fù)的

7、影響,并探討其促進(jìn)脊髓修復(fù)的作用機(jī)制。
　　 目的
　　 1.探討臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外分離、純化、擴(kuò)增的方法與條件,以及向神經(jīng)細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的可行性,為臍血干細(xì)胞移植治療脊髓損傷提供理論依據(jù)。
　　 2.探討氯化鋰體外誘導(dǎo)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向神經(jīng)細(xì)胞分化的可行性。
　　 3.制備脊髓去細(xì)胞支架,觀測(cè)脊髓內(nèi)基質(zhì)骨架的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。
　　 4.探索氯化鋰聯(lián)合臍血干細(xì)胞及脊髓去細(xì)胞

8、支架移植對(duì)大鼠脊髓全橫斷損傷的效果及其機(jī)制。
　　 方法
　　 1.無(wú)菌條件下收集正常足月兒的臍帶血,肝素抗凝,密度梯度離心法分離人臍血單個(gè)核細(xì)胞,貼壁法純化,用含15％FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面抗原。20ng/ml bFGF誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化,免疫組化鑒定神經(jīng)元特異性標(biāo)志蛋白MAP-2。
　　 2.取3代的臍血MSCs分3組進(jìn)行體外誘導(dǎo),A組:用含15％FBS和20ng/

9、mlbFGF的DMEM完全培養(yǎng)基預(yù)誘導(dǎo)24 h,3mol/LLicl的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)6d；B組:含3mol/L,Licl的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)7d；C組:含15％FBS的DMEM培養(yǎng)基正常培養(yǎng)7d。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),用免疫組化技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞NSE、MAP-2及GFAP的表達(dá)。
　　 3.取健康成年SD大鼠脊髓數(shù)段,每段長(zhǎng)約2cm,手術(shù)顯微鏡去除脊髓表面的脂肪組織和硬脊膜,分為A、B、C三個(gè)組,每組取1個(gè)標(biāo)本作為正常對(duì)照,其

10、余段均行化學(xué)萃取。A、B、C三個(gè)組的萃取振蕩頻率分別為80r/min、120r/min和160r/min。將標(biāo)本采用Triton X-100和脫氧膽酸鈉進(jìn)行萃取,蒸餾水漂洗后行切片HE染色和掃描電鏡觀察。萃取后的脊髓置于4℃無(wú)菌PBS溶液(0.01mol/L,pH7.4)中保存?zhèn)溆谩?br>　　 4.首先經(jīng)大鼠胸T9節(jié)段制備脊髓全橫斷損傷模型。120只成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為6組,每組20只:①A組為對(duì)照組:僅行T9平面脊髓全橫斷；②

11、B組為L(zhǎng)icl組:脊髓全橫斷+Licl(腹腔注射85mg/kg,1/日)；③C組為細(xì)胞移植組:脊髓全橫斷+UCB-SCs移植；④D組細(xì)胞支架聯(lián)合移植組:脊髓全橫斷+支架復(fù)合hUCB-SCs移植；⑤E組為L(zhǎng)id+細(xì)胞移植組:脊髓全橫斷+hUCB-SCs移植+Licl;⑥F組為L(zhǎng)icl+細(xì)胞支架聯(lián)合移植組:脊髓全橫斷+支架復(fù)合hUCB-SCs移植+Licl。于術(shù)后1d、3d及每周的最后一天,應(yīng)用BBB評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠脊髓功能的恢復(fù)情況；8周后取

12、材,通過(guò)HE染色及Brdu細(xì)胞核標(biāo)記觀察移植細(xì)胞的存活、遷移；通過(guò)免疫組化染色的方法,觀察hUCB-SCs向神經(jīng)細(xì)胞分化及表達(dá)神經(jīng)纖維的情況:通過(guò)熒光金逆行追蹤,觀察脊髓神經(jīng)纖維的再生與分布；綜合全面評(píng)價(jià)治療措施修復(fù)脊髓損傷的效果。
　　 結(jié)果
　　 1.采用密度梯度離心法成功從臍血中分離出臍血間充質(zhì)干細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示細(xì)胞不表達(dá)或弱表達(dá)CD14、CD34和CD45等造血干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志,但顯著表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞表面

13、標(biāo)志CD90和間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD105。經(jīng)20ng/ml bFGF誘導(dǎo)14天后長(zhǎng)梭形的MSCs胞體收縮,呈圓形、不規(guī)則多邊形,細(xì)胞出現(xiàn)類似神經(jīng)元形態(tài)。兔疫組化染色MAP-2呈弱陽(yáng)性表達(dá)。
　　 2.A組與B組誘導(dǎo)3d后細(xì)胞即出現(xiàn)形態(tài)學(xué)上的改變,細(xì)胞變成不規(guī)則形,立體感增強(qiáng),從胞體伸出突起。免疫組織化學(xué)和免疫熒光方法鑒定顯示,誘導(dǎo)后的細(xì)胞能表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志NSE和MAP-2,陽(yáng)性表達(dá)率A組(分別為73.6±7.

14、8％,75.5±8.5％)高于B組(分別為31.0±4.3％,33.5±5.0％)(P<0.05),而星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志GFAP陽(yáng)性細(xì)胞較少,A、B、C三組陽(yáng)性表達(dá)率分別為4.7±3.3％、5.1±4.6％、8.5±3.2％。
　　 3.采用化學(xué)萃取方法可以成功制備大鼠脊髓去細(xì)胞支架,其掃描電鏡結(jié)果顯示,采用120r/min的震蕩頻率萃取的脊髓去細(xì)胞支架內(nèi)基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)保存較好,基質(zhì)纖維走形與脊髓縱軸一致,呈波浪狀平行排列,彼

15、此之間有短橫向的基質(zhì)纖維相互連接成三維鏤空的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
　　 4.術(shù)后8周C、D、E、F組可觀察至Brdu標(biāo)記的臍血干細(xì)胞在體內(nèi)存活并在脊髓內(nèi)遷移,其中D、F組細(xì)胞存活數(shù)量多于C、E組(P<0.05)。FITC熒光標(biāo)記NF-200陽(yáng)性神經(jīng)纖維的表達(dá),在A組和B組未見(jiàn)表達(dá)；D、F組陽(yáng)性表達(dá)數(shù)高于C、E組(P<0.05),可見(jiàn)少量連續(xù)性神經(jīng)纖維通過(guò)損傷區(qū)。熒光金逆行脊髓追蹤顯示E組和F組在脊髓損傷區(qū)頭側(cè)中有少量被熒光金標(biāo)記的神經(jīng)錐體

16、細(xì)胞,而C組和D組偶見(jiàn)被熒光金標(biāo)記的神經(jīng)錐體細(xì)胞,對(duì)照組和單純氯化鋰組未見(jiàn)被熒光金標(biāo)記的神經(jīng)錐體細(xì)胞。后肢功能運(yùn)動(dòng)BBB評(píng)分除對(duì)照組和單純氯化鋰組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外,E組和F組的BBB評(píng)分較其他組提高(P<0.05),其中,F組好于E組,D組好于C組。
　　 結(jié)論
　　 1.臍血中可以分離并擴(kuò)增MSCs;臍血MSCs經(jīng)bFGF體外誘導(dǎo)可以向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化,并部分表達(dá)神經(jīng)元特異性標(biāo)志MAP-2。
　　 2.Licl

17、體外可誘導(dǎo)人臍血MSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,結(jié)合生長(zhǎng)因子bFGF預(yù)誘導(dǎo)可大大提高其誘導(dǎo)效果。
　　 3.采用化學(xué)萃取方法可以成功制備大鼠脊髓去細(xì)胞支架；脊髓去細(xì)胞支架保存有天然的脊髓內(nèi)基質(zhì)纖維骨架,可有效的引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)纖維定向生長(zhǎng)和遷移。
　　 4.氯化鋰能促進(jìn)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞在損傷區(qū)的存活并向神經(jīng)細(xì)胞分化,脊髓去細(xì)胞支架內(nèi)天然的脊髓基質(zhì)骨架能為脊髓兩側(cè)殘端基質(zhì)提供良好對(duì)接,阻止外源性瘢痕長(zhǎng)入,引導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)