鉛全抗原的制備及鉛抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)體系的建立.pdf

1、鉛是一種具有高蓄積性、多親和性的生理性和神經(jīng)性毒物,各國對(duì)食品與環(huán)境中的鉛殘留量均有嚴(yán)格的限制。鉛抗原與鉛抗體的制備是建立鉛酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試劑盒的基礎(chǔ)和關(guān)鍵,本研究運(yùn)用高度特異性的抗原抗體反應(yīng),及免疫競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合原理,采用雙功能螯合劑將鉛與牛血清白蛋白(BSA)橋接合成全抗原免疫Balb／c小鼠,對(duì)鉛抗體的檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)細(xì)胞融合等步驟制備抗鉛單克隆抗體,主要內(nèi)容如下:
　　 1)鉛全抗原的制備
　　 采用雙功能螯合劑

2、[(R)-2-氨基-3-(4-氨基苯基)丙基]-(S-S)環(huán)己烷-1,2二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-Chx-A"-Dtpa)制備重金屬鉛全抗原,分別用戊二醛法,重氮化法等方法,將螯合劑與牛血清蛋白(BSA)連接,再將合成的蛋白螯合劑復(fù)合物與鉛離子螯合得到全抗原BSA-P-NH2-Bn-Chx-A”-Otpa-Pb,其中戊二醛法與重氮化法得到的人工抗原,蛋白與鉛的偶聯(lián)比分別為1:15.64與1:42.95(1:42.95抗原為絮狀沉

3、淀物免疫效果不佳)。另外,本研究將戊二醛法予以優(yōu)化,將戊二醛法制備的蛋白螯合劑復(fù)合物與鉛離子進(jìn)行兩步螯合得到抗原BSA-P-NH2-Bn-Chx-A"-Dtpa-Pb,偶聯(lián)率提高到1:20以上。
　　 2)鉛抗體ELISA檢測(cè)方法的建立
　　 對(duì)間接ELISA檢測(cè)方法的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,建立起高效、快捷、方便的鉛抗體ELISA檢測(cè)方法。在初始操作流程的基礎(chǔ)上,對(duì)緩沖液種類、緩沖液Ph值,抗原包被時(shí)間,抗原包被溫度,等參數(shù)

4、進(jìn)行優(yōu)化,確定用Ph=7.4的HBS作為緩沖溶液,包被溫度與時(shí)間為37℃1h或4℃過夜；通過以上參數(shù)的確定,確定鉛抗體的ELISA檢測(cè)體系。
　　 3)抗鉛單克隆抗體的制備與鑒定
　　 將(1)中所制備抗原用于小鼠免疫實(shí)驗(yàn)并通過ELISA檢驗(yàn)其免疫效果,免疫程序設(shè)計(jì)上分別做了50μg、100μg兩個(gè)免疫劑量對(duì)照,并適當(dāng)增加了免疫次數(shù),四免后小鼠效價(jià)最高達(dá)到1:102400以上,計(jì)算不同包被抗原OD值的差異率達(dá)128％,證