白血病細(xì)胞多藥耐藥機(jī)制的蛋白質(zhì)組學(xué)及臨床意義的研究.pdf

1、腫瘤細(xì)胞多藥耐藥(MDR)的產(chǎn)生是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。為克服耐藥，深入研究其發(fā)生發(fā)展過程顯得十分重要。多藥耐藥的機(jī)理非常復(fù)雜。經(jīng)過不斷探索，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并明確了大量與耐藥相關(guān)的因素，已經(jīng)涉及細(xì)胞代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后修飾等各個(gè)方面。但以往研究結(jié)果表明，仍有許多耐藥現(xiàn)象并非現(xiàn)有的機(jī)制可以完全解釋。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞功能的改變，往往是多種因素變化的結(jié)果。觀察研究在同一時(shí)空中，細(xì)胞蛋白質(zhì)的總體變化及相互作用，才能更全面、更

2、深入的揭示腫瘤細(xì)胞耐藥的真正機(jī)制。 一、對三種細(xì)胞膜能量依賴的藥物排流“泵”蛋白PgP、MRP、LRP在129例急性髓性白血病病例中表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，分析了三者在初發(fā)和難治白血病中各自不同的表達(dá)情況。根據(jù)三種蛋白的表達(dá)情況將LRP或PgP或MRP單一表達(dá)陽性者定為：“單純性”；將L,RP或PgP或MRP兩項(xiàng)以上陽性者定為：“混合型”，觀察這種分型與臨床療效的關(guān)系。同時(shí)用MTT法觀察了白血病細(xì)胞對柔紅霉素(DNR)的敏感性。結(jié)果

3、發(fā)現(xiàn)：在AML初治組中耐藥蛋白表達(dá)陰性者的完全緩解(CR)率75.6％，耐藥蛋白表達(dá)陽性者CR率20.8％(“單純性”21.1％，“混合型”20％)；在AML復(fù)發(fā)及難治組中，耐藥蛋白表達(dá)為“混合型”CR率7.6％，耐藥蛋白表達(dá)為“單純性”CR率29.6％，“混合型”CR率低于“單純性”(P＜0.05)。表明LRP、PgP和MRP均與耐藥有關(guān)，這種“混合型”和“單純性”耐藥分類法，可以作為指導(dǎo)臨床治療和判斷療效的分類法。 二、通過

4、應(yīng)用二維熒光差異電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)，比較了K562和K562耐藥細(xì)胞之間蛋白質(zhì)表達(dá)質(zhì)和量的變化。二維電泳后經(jīng)過相應(yīng)軟件處理發(fā)現(xiàn)11個(gè)差異蛋白點(diǎn)，質(zhì)譜鑒定出9個(gè)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，其中5種蛋白質(zhì)與能量代謝有關(guān)；2種蛋白質(zhì)與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)；2種蛋白與細(xì)胞增生相關(guān)。9種差異表達(dá)蛋白質(zhì)中，3種蛋白質(zhì)在K562/ADM中表達(dá)增加，6種蛋白質(zhì)表達(dá)降低。表明二維凝膠電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對白血病多藥耐藥機(jī)制研究是一種新的可靠手段，可對揭示耐藥細(xì)胞與敏感細(xì)胞蛋

5、白組學(xué)變化和蛋白質(zhì)之間的相互作用提供新的思路。 三、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)，比較了K562及其耐藥細(xì)胞系K562/ADM、HL-60及其耐藥細(xì)胞系HL--60/ADM和Jurkat細(xì)胞及其用柔紅霉素處N72小時(shí)后，CRKL的活性變化。發(fā)現(xiàn)在CRKL在K562/ADM和HL-60/ADM中活性明顯增加，而在用柔紅霉素處理后的Jurkat細(xì)胞中其活性與未處理前比較無明顯差異。結(jié)果提示在化療藥物作用下，不同腫瘤細(xì)胞即可以出現(xiàn)機(jī)理相同的耐藥因素

6、，又有各個(gè)不同的特點(diǎn)，這為今后針對耐藥進(jìn)行特異性逆轉(zhuǎn)，提供了理論依據(jù)。 四、采用免疫印記及免疫熒光染色法對已知的四種CRKL傳導(dǎo)途徑中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)在耐藥細(xì)胞中，以Ras和PI3K途徑下游蛋白增加為主，表明CRKL參與耐藥，可能是以此兩種途徑為主。為進(jìn)一步探討CRKL蛋白在K562細(xì)胞耐藥中的作用。 五、針對已經(jīng)篩選確定的CRKL基因RNAi有效靶序列，合成靶序列的OligoDNA，退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)Hp

7、aI和XhoI切后的pGCL-GFP載體[含U6啟動子和綠色熒光蛋白(GFP)]連接產(chǎn)生LV-shCRKL慢病毒載體，PCR篩選陽性克隆，測序鑒定。用LV-shCRKL,pHelper1.0和pHelper2.0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，以293T細(xì)胞GFP蛋白的表達(dá)水平測定病毒滴度。PCR和測序證實(shí)，成功構(gòu)建CR-KLshRNA的慢病毒載體LV-shCRKL。然后分別轉(zhuǎn)染K562/S和K562/ADM并經(jīng)過Wes