DADS啟動(dòng)人白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、第一部分 DADS啟動(dòng)HL-60細(xì)胞凋亡模型的建立與鑒定
　　目的:尋找二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)誘導(dǎo)人白血病 HL-60細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)點(diǎn),建立 DADS啟動(dòng) HL-60細(xì)胞凋亡模型。
　　方法:實(shí)驗(yàn)設(shè)未處理組、處理組和撤藥組,分別采用倒置顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、DNA凝膠電泳、western blot等方法,進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,繪制生長(zhǎng)曲線,檢測(cè)凋亡率、活化的c

2、aspase-3以及 DNA Ladder、凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)。
　　結(jié)果:3.6mg L-1DADS作用HL-60細(xì)胞2d-6d,細(xì)胞數(shù)分別比對(duì)照組減少24.1％、36.5%、44.2%、52%、53.6%。處理后,細(xì)胞核濃縮,染色質(zhì)邊聚,可見凋亡小體。DADS作用1d、2d,凋亡率分別為3.1%、4.3%,與對(duì)照組(3.0%)無顯著性差異,而作用3d、4d、5d的凋亡率分別達(dá)到8.5%,15.2%,27.4%,均高于對(duì)照組(P

3、<0.05)。DADS作用2d-5d撤藥后再培養(yǎng)至第6d,凋亡率分別為7.9%,12.4%,16.5%,18.8%,高于對(duì)照組的3.3%(P<0.05)。處理2d-5d后,活化的caspase-3的表達(dá)率為10.0%,10.4%,14.9%,17.3%,均高于對(duì)照組5.4%(P<0.05)。DNA凝膠電泳顯示,處理組4d后出現(xiàn)明顯梯狀條帶,而撤藥組從2d-5d撤藥均出現(xiàn)明顯梯狀條帶。western blot結(jié)果表明, caspase-3

4、從作用2d起開始表達(dá)上調(diào),而 Bcl-2從2d起表達(dá)開始下調(diào)。
　　結(jié)論:1.DADS可誘導(dǎo)人白血病 HL-60細(xì)胞凋亡。
　　2.DADS誘導(dǎo) HL-60細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)點(diǎn)為3.6mg·L-1DADS處理2d。
　　第二部分 DADS啟動(dòng)HL-60細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　目的:本研究在建立 DADS啟動(dòng)人白血病 HL-60細(xì)胞凋亡模型的基礎(chǔ)上,應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究 DADS啟動(dòng)人白血病細(xì)胞凋亡過程中差異表

5、達(dá)的蛋白質(zhì),繪制蛋白質(zhì)差異表達(dá)圖譜,鑒定啟動(dòng)凋亡有關(guān)蛋白,探討 DADS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理,為尋找新型抗腫瘤藥物提供新靶標(biāo)。
　　方法:提取對(duì)照組和3.6mg·L-1DADS處理2d的HL-60細(xì)胞的總蛋白。固相PH梯度等電聚焦和SDS聚丙烯酰胺凝膠雙向電泳分離細(xì)胞總蛋白質(zhì);考馬斯亮藍(lán)染色對(duì)凝膠上的蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化檢測(cè);運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析軟件(PDQUEST)分析考染的蛋白質(zhì)圖譜;切割差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn),膠上原位酶解,

6、通過基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析,并采用生物信息學(xué)方法搜索 NCBInr、EMBL、SWISS-PROT等數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。
　　結(jié)果:DADS處理前后 HL-60細(xì)胞總蛋白質(zhì)雙向電泳,獲得重復(fù)性較好的雙向電泳考染圖譜。掃描成像及 PDQuest軟件分析,識(shí)別的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為對(duì)照組467±24個(gè),處理組385±18個(gè),其平均匹配率分別為82%和74%。兩組圖譜中有387個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)匹

7、配,193個(gè)點(diǎn)未被匹配,蛋白質(zhì)表達(dá)量相差2倍以上的29個(gè),其中22個(gè)上調(diào),7個(gè)下調(diào)。質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫搜索鑒定其中的9個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫搜索后,得分值>64分(P<0.05),獲得7個(gè)有意義蛋白。其中,Ras相關(guān) C3肉毒毒素酶解物2(Ras-related C3 botulinum toxin substrate2,Rac2),肌動(dòng)蛋白(ACTB protein,Actin),核結(jié)合因子β亞基(Core binding factor

8、, beta subunit isoform1),富小脯氨酸蛋白3(Small proline-rich protein3, SPRR3 protein),酯酶 D/谷胱甘肽甲?；饷? Esterase D/formylglutathione hydrolase),蛋白激酶 C相互作用蛋白底物類似物(PKCI-substrate analog)蛋白表達(dá)明顯上調(diào),而延長(zhǎng)因子( Elongation factor,EF)則表達(dá)下調(diào)。這些