膜磷脂對hEAG1鉀離子通道的調控研究.pdf

1、離子通道介導特定類型的離子有效跨膜流動，是細胞電活動產生的分子基礎，同時在機體的正常生理活動和病理過程中發(fā)揮重要作用。離子通道的功能異常會導致多種人類疾病，比如心律失調、以及癲癇等神經系統(tǒng)性疾病等。而越來越多的證據表明，離子通道的異常表達跟癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。比如，一些離子通道的調節(jié)劑已被證明具有抗腫瘤活性。鑒于離子通道在膜表面的定位以及一定結構和組織分布的特異性，使得離子通道成為治療多種相關疾病的潛在靶點。實際上，大約13%的藥物

2、都是通過靶向離子通道來行使其治療功能。在眾多離子通道中，鉀離子通道是種類最多的一種，鑒于它們的結構以及在多種疾病中扮演的角色，它們具有被開發(fā)成新的治療靶點的潛力。作為電壓門控K+通道的一個重要成員，人的etheràgo-go(hEAG1，Kv10.1，KCNH1)K+通道跟人體發(fā)育障礙以及70%以上腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，是潛在的腫瘤診斷標志物以及癌癥和神經障礙性疾病的治療靶標。盡管如此，由于缺乏內源性調節(jié)劑，我們對 hEAG1的生理調

3、控功能知之甚少。因此，尋找一種新的hEAG1內源性調控劑對深入研究該通道的生理特性和功能以及設計以hEAG1作為治療靶點的藥物就顯得十分必要。
　　磷脂是細胞膜上的重要組成成分，它們功能性調控膜蛋白是細胞行使自身功能和新陳代謝的必不可少的部分。PIP2作為膜內側最為豐富的一類磷脂，除了作為第二信使IP3和DAG的前體，其自身也被證明是多種離子通道行使功能的輔因子，如Kv、Kir、KCNQ和Cav等通道。通過與這些通道直接或間接的相

4、互作用，PIP2在細胞的信號轉導中扮演重要角色。鑒于PIP2對離子通道具有如此重要的調控功能，且未見其對 hEAG的研究報道，促使我們想了解PIP2是否也能夠調控hEAG1通道。
　　在CHO細胞中通過內面向外的膜片鉗技術，以及在HKE293T細胞中通過全細胞膜片鉗技術的結果我們發(fā)現(xiàn)，外源性的PIP2強烈地抑制hEAG1的K+電流。而通過雷帕霉素誘導轉移系統(tǒng)和5-羥色胺誘導的磷脂酶C活性信號通路來水解細胞膜上的PIP2也會增強hE

5、AG1在生理膜電位下的活性，表明PIP2能夠對hEAG1產生內源性的抑制。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，這種抑制作用不光具有濃度依賴性，而且對不同的磷脂具有選擇性，這種選擇性要求磷脂具有長鏈疏水尾及多個負電荷的磷酸頭。為了驗證PIP2是否直接地與hEAG1相互作用，我們使用一種新近發(fā)明的用于研究生物大分子和小分子結合的生物膜干涉技術（BLI）來檢測PIP2與hEAG1通道蛋白的結合動力學。通過該項技術，我們觀察了生理濃度下的PIP2與純化的hEAG

6、1通道蛋白的動態(tài)結合，結果顯示BLI測定所得的KD值和膜片鉗記錄得到的IC50結果具有很高的一致性，表明PIP2對hEAG1的直接調控作用。而進一步結合分子突變、電生理和BLI技術發(fā)現(xiàn)，PIP2通過結合到hEAG1的N末端的一段由12個氨基酸組成的區(qū)域來抑制該通道的活性。該PIP2結合區(qū)域也是Ca2+/CaM跟hEAG1的結合區(qū)域，盡管這兩個結合區(qū)域重疊，但電生理實驗表明它們之間并不會相互干擾彼此對hEAG1的結合和調控。PIP2同時展

7、現(xiàn)對hEAG2的抑制作用，hEAG1和hEAG2在PIP2結合區(qū)域的保守性表明N末端對PIP2調控這兩個通道至關重要。結合EAG通道的門控機制，我們推測PIP2可能通過結合在N末端區(qū)域來改變eag-CNBHD復合體的空間構象進而影響通道的門控行為。
　　基于上述實驗結果，我們得出以下結論：
　　（1）外源性的和內源性的PIP2都能夠抑制hEAG1的活性；
　　（2）BLI實驗顯示PIP2能夠與hEAG1直接相互作用；<

8、br>　?。?）PIP2結合hEAG1的位點位于該通道的N末端一段區(qū)域；
　　（4）盡管PIP2與鈣調蛋白（CaM）在hEAG1的結合位點重疊，但它們在功能上并不相互影響。
　　總之，我們的實驗證明了PIP2是hEAG1新的內源性調控劑，這也提示通過操控PIP2的信號通路可能會為治療hEAG1相關的離子通道病提供一個策略。
　　本論文的主要創(chuàng)新點：
　　（1）首次證明了PIP2能夠調控hEAG1，并確立了PIP2