Sp1對FHL2轉錄調控機制的研究.pdf

1、目的和意義: FHL2（Four and ahalf LIM Protein2）為新確定的癌基因，在胃腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。關于FHL2下游的轉錄調控已有了一定的報道研究，但對其上游的相關調控尚無文獻報道。本研究擬對人新癌基因FHL25’端上游進行生物信息學分析以預測其5’端啟動子位置和轉錄調控元件。 材料和方法: 1、主要材料; Kato-Ⅲ、SW480和LoVo細胞，雙熒光素酶報

2、告基因檢測試劑盒，核蛋白提取試劑盒，poly（dl-dC），γ-32P，LipofectAMINE2000 Reagent，TRIzol，Sp1抗小鼠單克隆抗體，F(xiàn)HL2抗兔多克隆抗體，MithramycinA。 2、方法; 結果: 1、FHL2基因啟動子熒光素酶報告基因質粒的構建及鑒定擴增了4段FHL2基因5’端上游啟動子序列，大小分別為1008bp、881bp、595bp及382bp。上述片段分別插入到pGL

3、3-Basic載體構建成重組質粒，命名為pLuc-1008、pLuc-881、pLuc-595及pLuc-382。酶切鑒定與熒光素酶基因片段相符，證實載體構建成功。DNA測序報告顯示與Genbank中序列完全吻合。 2、胃腸癌細胞株中FHL2重組啟動子報告基因活性檢測; pGL3-Basic載體含有熒光素酶基因序列，并且載體本身不包含啟動子，克隆入啟動子后可用熒光素酶定量直觀地比較兩個啟動子的活性及其在各種不同種類細胞

4、系中表達的組織特異性，并以pRL-CMV質粒作為內(nèi)參以消除轉染效率的不同所帶來的差異。重組質粒轉染不同胃腸癌細胞后，熒光素酶活性RLU值（相對熒光單位）有不同的改變，表明所構建的FHL2基因啟動子報告系統(tǒng)有轉錄活性。4個不同的重組質粒在胃癌Kato-Ⅲ細胞中活性分別為22.34±5.43，20.19±3.85，38.05±2.04和5.25±1.10；腸癌LoVo細胞中活性分別為4.30±0.85，4.65±0.68，9.46±2.31

5、和3.10±0.51；腸癌SW480細胞中活性分別為2.68±0.15，2.02±0.08，3.31±0.23和1.85±0.42。3株腫瘤細胞中均為pLuc-595的RLU值最高（方差分析/Welch整體檢驗，F(xiàn)/Welch值分別為43.421，20.682和7.345，P值分別為0.000，0.000和0.038）。 3、免疫組織化學驗證Sp1表達與FHL2表達成正相關; 收集大腸及胃的癌旁粘膜和腫瘤組織石蠟標本進行

6、免疫組織化學檢測。Sp1在40例癌旁腸粘膜組織中，表達為陰性的有22例，弱陽性的有8例，陽性的有8例，強陽性的有2例，平均秩為32.98；在44例腸癌組織中，表達為陰性的有12例，弱陽性的有3例，陽性的有16例，強陽性的有13例，平均秩為51.16，表達較癌旁組織增強具有顯著性（兩等級資料秩和檢驗，P=0.000）；在13例癌旁胃粘膜組織中，表達為陰性的有10例，弱陽性的有3例，無陽性及強陽性表達，平均秩為10.04；在15例胃癌組織中

7、，表達為陰性的有4例，弱陽性的有5例，陽性的有4例，強陽性的有2例，平均秩為18.37，表達較癌旁組織增強具有顯著性（兩等級資料秩和檢驗，P=0.000）。FHL2在34例癌旁腸粘膜組織中，表達為陰性的有33例，弱陽性的有1例，無陽性及強陽性表達，平均秩為21.72；在38例腸癌組織中，表達為陰性的有8例，弱陽性的有7例，陽性的有15例，強陽性的有8例，平均秩為49.72，表達較癌旁組織增強具有顯著性（兩等級資料秩和檢驗，P=0.000

8、）；在12例癌旁胃粘膜組織中，表達為陰性的有10例，無弱陽性表達，陽性的有1例，強陽性的有1例，平均秩為8.79；在16例胃癌組織中，表達為陰性的有1例，弱陽性的有4例，陽性的有7例，強陽性的有4例，平均秩為18.78，表達較癌旁組織增強具有顯著性（兩等級資料秩和檢驗，P=0.000）。對同時進行了Sp1和FHL2的表達檢測的34例大腸癌病人使用相關分析Spearman檢驗得到R=0.469，P=0.005，提示Sp1表達與FHL2表達

9、相關，且隨著Sp1表達量增高FHL2的表達量也增高。 4、Sp1能與FHL2啟動子特異結合; 根據(jù)TFsearch軟件分析得出FHL2啟動子上游中Sp1可能的轉錄結合位點設計了兩對探針分別為：探針1：（-485）5'agagggcccgggcttggaatgt3’（-464），探針2：（-123）5'tgccaccgcgcccaggcctcgt3'（-102）。以腸癌SW480細胞核提取物進行結合反應，電泳后曝光，標記的

10、探針1+核蛋白抽提物泳道中出現(xiàn)一條特異的結合帶，使用50倍未標記的探針1冷競爭反應后條帶消失，而探針2泳道中未發(fā)現(xiàn)條帶。提示探針1能與目的核蛋白中的Sp1特異結合，而探針2不能與轉錄因子Sp1結合。使用標記的突變探針1進行競爭反應該條帶消失，進一步證實了Sp1能與FHL2啟動子特異結合。 5、定點突變FHL2重組啟動子后報告基因檢測活性下降; 根據(jù)凝膠阻滯實驗結果，按照定點突變試劑盒設計突變引物將探針-485agaggg

11、cccgggcttggaatgt-464中Sp1位點突變?yōu)閍gaggAccAggTcttggaatgt。突變后的質粒經(jīng)測序鑒定證實。將pLuc-595和pLuc-MT分別轉染入Kato-Ⅲ、SW480和LoVo細胞中比較熒光素酶活性變化。三株細胞中pLuc-MT的RLU值均較pLuc-595的RLU值降低具有顯著性（兩獨立樣本t檢驗，t值分別6.218、42.772和8.377，P值分別為0.003、0.000、0.001）。

12、6、siRNA及MIT抑制Sp1表達后FHL2重組啟動子報告基因檢測活性下降; 在三株細胞中MIT實驗組啟動子活性較陰性對照組活性下降均有顯著性差異（P均<0.05）。SW480和LoVo細胞Sp1-siRNA實驗組啟動子活性較陰性對照組活性下降有顯著性差異（P均<0.05）：但Kato-Ⅲ細胞Sp1-siRNA實驗組的RLU值較陰性對照組RLU值下降無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 7、siRNA及MIT抑制Sp1表達后

13、FHL2 mRNA及蛋白表達下降; Kato-Ⅲ、SW480和LoVo三株細胞中的Sp1-siRNA實驗組和MIT實驗組Sp1 mRNA水平均較陰性對照組中Sp1 mRNA水平顯著降低（P均<0.05），提示設計的Sp1-siRNA能有效抑制Sp1的mRNA表達。實驗組FHL2 mRNA水平較陰性對照組FHL2 mRNA水平也有顯著性降低（P均<0.05）。蛋白水平的檢測也有類似的結果（P均<0.05）。 結論:

14、 獲得了新癌基因FHL2的5'端啟動子序列及轉錄調控信息，根據(jù)Sp1結合位點設計克隆的1008bp、881bp、595bp及382bp大小的FHL2啟動子片段在胃腸癌細胞中有不同的轉錄活性，其中以pLuc-595活性最高。臨床標本免疫組織化學檢測提示Sp1和FHL2在胃腸道腫瘤組織中均較癌旁正常組織高表達，且隨著Sp1表達量增高FHL2的表達量也增高，兩者在腫瘤組織中的表達量成正相關。通過EMSA進一步證實了Sp1能與FHL25'端啟