西紅花苷對心肌細(xì)胞離子通道調(diào)控作用的研究.pdf

1、西紅花（Crocus sativus L）在臨床上的應(yīng)用已有幾千年的歷史，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神等功效。常被用于治療經(jīng)閉癥瘕、產(chǎn)后瘀阻、溫毒發(fā)斑、憂郁痞悶、驚悸發(fā)狂等癥?，F(xiàn)代《中藥大辭典》載其“活血化瘀、解郁開結(jié)之功效，主治胸膈痞悶、憂思郁結(jié)、吐血、傷寒發(fā)狂、驚悸恍惚、婦女經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀血腹痛、跌撲腫痛?！蔽骷t花中含有150多種化合物，其中西紅花苷（crocin）是其主要有效成分之一。近年來，越來越多的研究表明，西紅花苷具有降血

2、壓、降血脂、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗抑郁、增強記憶、抗粥樣動脈硬化及神經(jīng)和心臟保護(hù)作用。實驗研究證明，西紅花苷具有抑制豚鼠心肌收縮的藥理作用。
　　鈣通道電流是細(xì)胞動作電位的重要電流，在形成動作電位的平臺期和興奮-收縮偶聯(lián)方面起重要作用。L型鈣通道（ L-type calcium channel, LTCCs）主要存在于肌細(xì)胞和分泌細(xì)胞中。心肌細(xì)胞的收縮是由于心肌細(xì)胞的興奮而引起LTCC的開放，外鈣內(nèi)流，胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高，并

3、通過鈣誘導(dǎo)鈣釋放（CICR）的方式使肌質(zhì)網(wǎng)在短時間內(nèi)釋放大量鈣離子，從而引起心肌收縮。在病理狀態(tài)下，觸發(fā)鈣釋放則會導(dǎo)致心肌細(xì)胞舒張期鈣濃度過高，從而形成鈣超載，引起心律失常和細(xì)胞損傷。因而，鈣拮抗劑的作用就是降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣濃度以改善心肌細(xì)胞的正常生理功能。
　　電壓門控性鉀通道參與調(diào)解動作電位，并起到重要作用。其中延遲整流鉀電流是引起心肌細(xì)胞動作電位復(fù)極的主要的外向鉀電流，分為快速激活延遲整流鉀電流（the rapid comp

4、onent of IK，IKr）和慢速激活延遲整流鉀電流（the slow component of IK，IKS）。研究顯示，能夠誘導(dǎo)引發(fā)QT間期延長的藥物均能在不同程度上阻斷 IKr。并且由于藥物與心肌細(xì)胞鉀離子通道蛋白的相互作用，IKr的阻滯還會引起長QT間期綜合征（long QT syndrome，LQTS）。近來，制藥工業(yè)普遍通過研究藥物對 IKr通道的作用來評價新藥致心律失常的風(fēng)險。
　　近年來，盡管有文獻(xiàn)表明croc

5、in具有心肌保護(hù)作用，但是crocin對心肌細(xì)胞上的鈣電流，延遲整流鉀電流，鈣瞬變和收縮力的影響的研究還未見報道。我們推測crocin是通過阻斷LTCCs發(fā)揮心肌保護(hù)的作用。
　　目的：觀察crocin對心肌細(xì)胞上的鈣電流，延遲整流鉀電流，鈣瞬變和收縮力的影響，以探究其心肌保護(hù)作用的細(xì)胞學(xué)機制。
　　方法：通過膜片鉗技術(shù)（Patch-clamp）和細(xì)胞收縮與離子濃度同步測量系統(tǒng)（IonOptix），觀察 crocin對大鼠急

6、性分離的心肌細(xì)胞鈣電流，鈣瞬變及細(xì)胞收縮的影響。用Patch-clamp觀察crocin對表達(dá)在HEK293細(xì)胞上的IKs和IKr的影響。
　　結(jié)果：
　　1心室肌細(xì)胞鈣電流（ICa-L）的確定
　　全細(xì)胞電壓鉗模式下，將鉗制電壓設(shè)置為-80 mv，施以-80 mv去極化至0 mv，持續(xù)200 ms，頻率為0.5 Hz的去極化脈沖，記錄到ICa-L。當(dāng)電流穩(wěn)定后，用含0.01 mM的尼卡地平（Nicardipin，Ni

7、c）的臺氏液灌流，電流基本被阻斷（P<0.01），說明所測電流為鈣電流。用含0.1 mM的氯化鎳（NiCl2）的臺氏液灌流，電流基本沒變化嗎，說明這些電流不是 T型鈣電流，用含0.01 mM的維拉帕米（Verapamil，Ver）的臺氏液灌流基本阻斷電流（P<0.01），說明記錄的是L型鈣電流（n=5-7）。
　　2 Crocin對心室肌細(xì)胞ICa-L的抑制作用
　　300μM的crocin可以明顯抑制鈣電流。細(xì)胞外液沖洗后

8、，鈣電流可部分恢復(fù)到給藥前水平。通過連續(xù)給六個不同濃度的crocin（1，3，10，30，100和300μM）后發(fā)現(xiàn)crocin濃度依賴性的抑制鈣電流，抑制率分別為9.53±0.87％，13.04±1.03%，29.66±1.5%，39.11±1.85%，60.23±1.90%和72.20±1.54%（n=9-12）。
　　3 Crocin對ICa-L電流-電壓（I-V）關(guān)系曲線的影響
　　通過繪制給藥前，給三個濃度的cro

9、cin（3，30和300μM）以及0.01 mM的維拉帕米的I-V關(guān)系曲線，發(fā)現(xiàn)曲線隨crocin濃度的增加而逐步上移，說明crocin濃度依賴性的抑制ICa-L。然而I-V關(guān)系以及反轉(zhuǎn)電位并沒有明顯變化。
　　4 Crocin對心室肌細(xì)胞ICa-L穩(wěn)態(tài)激活和失活曲線的影響
　　通過繪制給藥前及給不同濃度的crocin（3和30μM）后，心室肌細(xì)胞 ICa-L的穩(wěn)態(tài)激活和失活曲線，發(fā)現(xiàn) crocin對 ICa-L的穩(wěn)態(tài)激活和

10、失活無顯著性的作用。給藥前以及各濃度 crocin的激活曲線的半最大激活電壓（V1/2）/斜率因子（k）分別為-10.93±0.66 mV/7.04±0.59，-8.75±0.59 mV/7.23±0.53，-6.88±0.49 mV/7.53±0.44。失活曲線的V1/2/k分別為-34.22±0.09 mV/4.88±0.08，-33.27±0.17 mV/5.05±0.10，-34.05±0.14 mV/5.33±0.12（n=8

11、-10）。
　　5 Crocin對IKs，IKr的影響
　　300μM crocin對IKs，IKr均無明顯作用，抑制率為2.70±0.8%，3.78±0.4%（P>0.05，n=6）。
　　6 Crocin對心室肌細(xì)胞收縮與細(xì)胞鈣瞬變的影響
　　結(jié)果顯示1μM crocin能夠明顯的抑制心室肌細(xì)胞的收縮，抑制率為44.64±2.12%，鈣瞬變的峰值也下降了23.66±4.52%（P<0.05, n=6-8）。7

12、 Crocin對心室肌細(xì)胞收縮的時間參數(shù)的影響
　　1μM crocin明顯抑制心室肌細(xì)胞收縮達(dá)峰時間的10%（Tp）及恢復(fù)基線水平時間的10%（Tr）；抑制率分別為40.92±15.83%及7.47±1.79%（P<0.05，n=6-8）。
　　結(jié)論：
　　在本研究中，我們探討了crocin的心臟保護(hù)的可能機制。研究結(jié)果表明，crocin可濃度依賴性的抑制心室肌細(xì)胞ICa-L，抑制心室肌細(xì)胞收縮，降低心室肌細(xì)胞內(nèi)鈣離